点击显示 收起
Ou Liwen，Zhang Ping，Tang Guohua，et al.
Medical College of Nanhua University，Hengyang，Hunan421001.
【Abstract】 Objective To study effect of polysaccharide nucleic acid of Bacillus Calmette Cuerin on bronˉchoalveolar lavage fluids（BALF）of mouse models.Methods Eighteen wistar mice were divided into three groups:model group（group B，six mice，sensitized with OVA and Al（OH） 3 plus challenging with OAV by aerosol）;BCG-PSN prvention group（group C，six mice，sensitized with OVA and（Al（OH） 3 ）plus challenging with OAV by aerosol and receiving intrmusularly BCG-PSN（0.025g/kg）in the course of sensitization）;amodel control group（group A，six mice，sensitized and challenging with normal saline）.The total cell counts，EOS counts，EOS apoptosis in BALF were examined，and the level of IL-4and IL-12were detected by ELISA.Results The level of IL-4and IL-12，the total cell counts，EOS counts，and EOS apoptosis were7.383±2.145pg/ml，8.043±2.680pg/ml，（1.695±0.797）×10 8 ，（0.833±0.408）×10 6 ，16.233%±6.647%in group A;26.479±4.820pg/ml，5.482±2.080pg/ml，（17.850±4.428）×10 8 ，（6.667±2.338）×10 6 ，8.483%±3.733%in group B;19.794±2.130pg/ml，11.296±2.058pg/ml，（10.098±1.865）×10 8 ，（3.833±0.753）×10 6 ，32.267%±7.535%in group C.The differences of IL-4level，total cell counts and EOS counts in group B and C were significant as compared with group A（P<0.001）;the difference of IL-12level in group B was not significant as compared with group A（P>0.05）;the difference of IL-12level in group C was significant as compared with group A（P<0.05）.The difference of EOS apoptosis in group B was significant as compared with group A（P<0.05）;the difference of EOS apoptosis in group C was significant as compared with group A（P<0.001）.The differences of IL-4level，IL-12level，EOS apoptosis，total cell counts，EOS counts in group C were significant（P<0.02，P<0.001，P<0.005，P<0.05）as compared with group B.The close correlations between EOS counts and IL-4，and betweet IL-12and EOS apoptosis were demonstrated（r=0.76，P<0.05;r=0.75，P<0.05）;no close correlations between EOS counts and IL-12，between IL-14and EOS apoptosis were demonstrated（r=0.20，P>0.05;r=0.39，P>0.05）.Conclusion There is a unbalance of IL-12/IL-4（Th1/Th2）and inˉflammation in bronchoalveolar of asthma mouse model.BCG-PNS may regulate the unbalance ofTh1/Th2，increase EOS apoptosis and inˉhibit airway inflammation.
Key words asthma IL-12/IL-4 airway inflammation BCG-PNS
哮喘是由多种炎症细胞和细胞组份参与的气道慢性炎症疾患。近年来，随着研究的深入，Th1/Th2细胞比例失衡是哮喘主要发病机制的观点越来越被多数学者所接受。目前已证明IL-12和IL-4分别是Th1/Th2分泌的炎症抑制因子/炎症促进因子，亦是诱导Th0向Th1/Th2分化的关键因子 ［1］ 。卡介苗（BCG）作为免疫调节剂，能诱导γ-干扰素的产生和Th1细胞的增殖活化 ［2］ 。本研究旨在观察哮喘大鼠气道中IL-12、IL-4浓度变化和气道炎症反应，以及致敏期间用BCG衍生物（BCG-PSN）干预后对其的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar雄性大鼠（月龄2～3个月，体重200±50g）18只（购于中南大学动物部），随机分3组:对照组（A组），哮喘组（B组），BCG-PSN干预组（C组）。卵蛋白粉（OVA武汉博士德公司），大鼠IL-12、IL-4酶联免疫（ELISA）试剂盒（上海森雄公司），Optirep液（挪威Axis-shield公司），酶标仪（EL×800，美国Bio-Tekinstrument INC），Epics Altra型流式细胞仪（美国BECMAN COULTER公司），BCG-PSN（陕西生物制品研究所），402A雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司），显微镜（Nikon），离心机（美国Sigma公司），自制雾化吸入箱，Al（OH） 3 （本校免疫室）。
1.2 方法
1.2.1 哮喘模型的建立 ［3］ B组:第1～7天分别腹腔注射含OVA10mg、Al（OH） 3 200mg的混悬液2ml致敏，第8天开始以1%OVA液雾化吸入，每天1次，每次60min，连续7天;A组:用生理盐水代替OVA和AL（OH） 3 ，余处理同B组;C组:在致敏期间每天腹腔注射1次BCG-PSN（0.025g/kg），余处理同B组。
1.2.2 支气管肺泡灌洗液（BALF）收集 各组大鼠末次激发24h后用戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉，在环状软骨上用止血钳固定，其下方作横切口，置入连接注射器的硅胶管，分3次注入37℃生理盐水各1ml，并立即回收BALF（回收率70%左右）。
1.2.3 IL-12、IL-4浓度测定 将BALF1.5ml以1500r/min离心10min，取上清液贮存于-20℃冰箱，在1个月内用ELISA法按操作说明测定IL-12、IL-4浓度。重悬液2h内作细胞计数、EOS数及EOS凋亡率。
1.2.4 炎症细胞总数、EOS数测定 依照参考文献 ［4］ 取重悬液0.1ml，用计数板直接计数炎症细胞总数，用重悬液50μl，按1:5比例加EOS稀释液，用计数板直接计EOS数。
1.2.5 EOS凋亡率测定 依照参考文献 ［5］ 自制密度为1.09kg/L和1.08kg/L的Optirep液各1.5ml，先后加入离心管。取重悬液1.0ml，用等量生理盐水稀释，离心洗涤2次后，生理盐水重悬细胞，用350目尼龙筛过滤，取滤液沿壁轻轻加入上述离心管，以2000r/min离心20min。收集中间层细胞，测定EOS浓度>85%，细胞活力（台盼蓝染色）>95%。将收集的细胞用70%乙醇固定24h。上机前用生理 盐水洗涤1次，加红色（PI）工作液避光15min后，上流式细胞仪检测。
1.2.6 统计学分析 实验数据用ˉx±s表示，组间比较用样本均数t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 BALF中IL-12、IL-4的浓度
2.1.1 IL-12的浓度 与A组（8.043±2.680）pg/ml比较，B组（5.482±2.080）pg/ml降低，但差异无显著性，C组（11.296±2.058）pg/ml升高，差异有显著性;与B组比较，C组约为B组的2倍，差异有显著性。
2.1.2 IL-4的浓度 与A组（7.383±2.145）pg/ml比较，B组（26.478±4.820）pg/ml约为A组3～4倍，C组（19.794±2.130）约为A组2～3倍，差异均有显著性;与B组比较，C组较B组低，两组差异有显著性。见表1。
表1 各组大鼠模型BALF中IL-12、IL-4的浓度 （略）
注:与A组比较， △ P>0.05， ▲ P<005， ★ P<0.001;与B组比较， ■ P<0.001，P<0.02
2.2 BALF中的炎症细胞总数、EOS数和EOS凋亡率 与A组比较，B组炎症细胞总数约为A组12～13倍，EOS数约为A组7～8倍，EOS凋亡率约为A组1/2，差异均有显著性;C组炎症细胞总数约为A组6倍，EOS数约为A组4～5倍，EOS凋亡率约为A组2倍，差异均有显著性。与B组比较，C组EOS数、炎症细胞总数均降低，约为B组的1/2，EOS凋亡率升高，约为B组4倍，差异均有显著性。见表2和图1～3。
表2 BALF中炎症细胞总数、EOS数和EOS 凋亡率 （略）
注:与A组比较， △ P<0.001， ▲ P<0.05， ☆ P<0.005;与B组比较，P<0.005， ■ P<0.05， ● P<0.001
2.3 BALF中IL-4、IL-12与EOS数、EOS凋亡率的相关性 与A组比较，B组中IL-12的浓度与EOS凋亡率均降低，EOS数与IL-4均升高;C组中IL-12、IL-4、EOS数、EOS凋亡率均升高;与B组比较，C组中IL-12的浓度与EOS凋亡率均升高，EOS数与IL-4均降低。三组中IL-12与EOS数无相关性（r=-0.20，P>0.05），IL-12与EOS凋亡率有相关性（r=0.75，P<0.001）;IL-4与EOS数有相关性（r=0.76，P<0.001;IL-4与EOS凋亡率无相关性（r=039，P>0.05）。见图4，图5。
3 讨论
Th1/Th2平衡是机体行使防御、自身稳定和免疫监视的重要机制。近年来大量资料证实Th1/Th2比例下降与哮喘密切相关。目前证明IL-12与IL-4是与哮喘有关的细胞因子，在哮喘发病中起重要作用。IL-4能促进Th0分化为Th2，同时促进Th2分泌IL-5、IL-13等炎症促进因子，间接抑制Th1分泌IFN-γ、IL-2等炎症抑制因子，合成IgE，而且诱导血管内皮细胞（VEC）表达CC型趋化因子-3（eotaxin-3），后者与EOS表面CCR3结合，EOS受eotaxin-3作用迁移至炎症中心。IL-12是Th1分泌的一种炎症抑制因子，也是Th0向Th1分化的重要诱导因子，通过抑制CCK3，从而抑制骨髓细胞CD34 + 分化形成EOS，又抑制Th2细胞免疫应答来降低IL-4和IgE的浓度。国外资料认为 ［6］ :IL-12作为关键性调节细胞因子，对遗传性过敏症和哮喘患者起重要作用。IL-12的浓度降低，引发IgE反应，导致哮喘发生;增加IL-12的浓度能抑制上述过程。本实验研究发现，哮喘组IL-4浓度较对照组升高3～4倍，与陈萍等 ［7］ 报道的结果相似;IL-12浓度较对照组降低，细胞总数、EOS数显著升高，EOS凋亡率约为对照组的1/4。提示致敏原致敏激发后，哮喘动物模型气道中存在Th1/Th2失衡，机体以Th2免疫应答占优势，间接抑制Th1免疫应答，从而使Th2分泌的炎症促进因子（如IL-4）增多，Th1分泌的炎症抑制因子（如IL-12）减少，EOS凋亡率降低，气道出现大量的炎症细胞（如EOS）。近年来对卡介菌的一系列研究发现，卡介菌的DNA提取物（MY-1）刺激人外周血细胞，发现外周血细胞表面物质中IL-8升高，且IL-8能拮抗对IgE诱导 ［8，9］ 。BCG-PSN为BCG的衍生物，具有很强的非特异性免疫刺激作用。本研究发现哮喘大鼠模型BALF中，反映气道炎症的细胞总数和EOS数在BCG-PSN干预组较对照组升高，但比哮喘组明显降低;反映Th2功能的炎症促进因子（如IL-4）在BCG-PSN干预组较对照组升高，但比哮喘组明显降低;反映Th1功能的炎症抑制因子（如IL-12）在BCG-PSN干预组较对照组和哮喘组均升高。但是，BCG-PSN干预组和哮喘组比较，IL-12上升的幅度比BCG-PSN干预组和对照组上升的幅度更有意义，与国外文献报道的结果相似 ［10］ ;更有意义的是，BCG-PSN干预组EOS凋亡率约为对照组的2倍，约为哮喘组的4倍， 且IL-12与EOS凋亡率有相关性（r=0.75，P<0.001），而与EOS数无相关性（r=-0.20，P>0.05）;IL-4与EOS数有相关性（r=0.76，P<0.001），而与EOS凋亡率无相关性（r=039，P>0.05）。分析其原因，可能是:（1）BCG-PSN在一定程度上纠正哮喘大鼠气道Th1/Th2（如IL-12/IL-4）失衡，使炎症抑制因子分泌增加，炎症促进因子分泌减少，从而抑制气道变态性炎症。（2）BCG-PSN通过上调炎症抑制因子（如IL-12）的浓度，下调炎症促进因子的浓度来启动哮喘大鼠模型EOS凋亡机制，使气道中EOS凋亡增加，间接抑制气道EOS生存，从而抑制气道变态性炎症。BCG-PSN如何启动EOS凋亡，目前报道不多，值得进一步探讨。总之，BCG-PSN作为非特异性调节剂，用于防治哮喘具有良好的前景。
（本文图片见附页1）（略）
参考文献
1 张宁，徐永健，张政样.辅助性T细胞功能分化的分子机制.国外医学·呼吸系统分册，2003，3（2）:57-61.
2 Hopkin JM.Atopy，asthma and mycobacteria.Thorax，2000，35:443-445.
3 Salmon M，Walsh DA，Koto H，et al.Kepeated allergen exposure of sensitized Brown-Norway rats induces airway cell DNA synthesis and remodelling.Eur Respir J，1999，14:633-641.
4 朱立华.临床基础检验学实验指导.北京:人民卫生出版社，2000，30-33.
5 毕玉田，杨肇亨，王长征.哮喘豚鼠肺组织中嗜酸细胞凋亡与白细胞介素5mRNA表达的相关性.中华呼吸与结核杂志，1999，22（4）:208-230.
6 Wills-krap M.IL-12/IL-13axis in allergic asthma.J Allery Clin Immunol，2001，107:9-18.
7 陈萍，张云志，海涛，等.阻断CD28-CD86共刺激途径抑制哮喘小鼠气道炎症的研究.中华内科杂志，2003，42（11）:805-806.
8 Fujieda S，Iho S，Kinura Y，et al.DNA formmycobacterium bovis bacilˉlus calmette-guerin（MY-1）inhibits immunoglobulin production by human lymphocytes.Am J Respir crit Care Med，1999，160:2056-2061.
9 Fuiton SA，Martin TD，Redline RW，et al.Pulmonary immune responses during primary Mycobacterium bovis-calmette-guerin bacillus infecˉtion in C57BI/6mice.Am Jrespir Cell Mol Biol，2000，22:333-343.
10 Hopfenspirger MJ，Pair SK，Hopp KJ，et al.Mycobacterial antigens attenuate late phase response，airway hyperresponsiveness，and bronˉchoalreolar larage eosinophilia in a mouse model of bronchial asthma.Int Immunopharmacol，2001，（9-10）:1743-1751.
基本项目:湖南省教育厅科研资助项目（编号:03C419）
作者单位:421001湖南衡阳南华大学医学院