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its changes after drug treatment
Li Zhikui，Liu Gang，Wang Changzheng，et al.
Department of Respiratory Medicine，Xi Jing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi’an710032.
【Abstract】 Objective To study the ralation between the apoptosis and bcl-2expression in eosinophils of bronchoalveolar lavage fluid（BALF）in asthmatic guinea pig and its changes after drug treatment.Methods Dexamˉethasone（DM），triptolide（TP）and aminophylline（AM）have been used in guinea pig of allergic asthma.Apoptosis were detected by TdT-mediated dUTP nick end labeling，bcl-2mRNA expression were measured by hybridization.Reˉsults Apoptotic eosinophils in asthma group were significantly less than normal control group（P<0.01），and inˉcreased after administration of DM，TP and AM respectively（P<0.01）.bcl-2mRNA of Eos was moderately exˉpressed in normal guinea pig，increased in asthma group and decreased significantly after treatment of DM and TP（P<0.05）.Conclusion Bcl-2may be one of the important factors regulating apoptosis of eosinophils in asthma.DM and TP can down-regulate the bcl-2expression，then promoting apoptosis on eosinophils in guinea pig lung of allerˉgic asthma.
Key words asthma eosinophil apoptosis bcl-2
嗜酸性粒细胞（eosinophils，Eos）聚集、活化及其高毒性阳离子蛋白的释放在哮喘发病过程中发挥着重要作用。以往人们注意到Eos的渗出依赖IL-5，但对Eos炎症反应的控制研究很少。不断有证据表明细胞死亡是由细胞凋亡引起，Eos凋亡减少是哮喘Eos增加的重要原因之一。bcl-2可阻抑细胞生理性死亡的分子过程，在转基因小鼠，bcl-2过表达可明显抑制T、B及中性粒细胞的凋亡，提高它们的存活能力。在严重哮喘患者痰中的Eos，有明显的bcl-2表达，且其表达与Eos阳离子蛋白及IL-5的水平呈正相关，而与FEV 1 /FVC呈负相关，表明哮喘时，bcl-2可延长气道中的Eos存活 ［1］ 。目前bcl-2在不同密度Eos凋亡中的作用机制研究很少。推测也将在Eos凋亡中发挥重要作用。本实验用地塞米松、雷公藤甲素及氨茶碱干预，观察哮喘豚鼠肺内不同密度Eos bcl-2表达与Eos细胞凋亡关系，以进一步了解哮喘肺组织Eos bcl-2表达与细胞凋亡及细胞凋亡与炎症清除的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒（In Situ Cell Death Detection Kit，POD）:购自德国Boehringer Mannheim（B.M）公司。总RNA提取试剂盒（TriPure lsolation Regent），德国B.M公司。寡核苷酸探针3′末端标记试剂盒（Dig Oligonuˉcleotide3′-end Labling Kit），德国B.M公司。Percoll分离液:Pharmacia，瑞典。抗地高辛（Dig）抗体:BM，德国。
1.2 动物分组 健康豚鼠30只购自第三军医大学实验动物中心，体重200～250g，雌雄不拘，随机分为5组（每组6只）:正常对照组、哮喘组、地塞米松（DM）组、雷公藤甲素（TP）组及氨茶碱（AM）组。哮喘动物模型制备参照文献 ［2］ 。在第1天和第8天，将2%卵蛋白（OA，溶于生理盐水）与等量的氢氧化铝凝胶混匀后，豚鼠腹腔内注入0.5ml。在第15天，将豚鼠置密闭容器内，2%OA气雾进行激发，把动物暴露在OA中至哮喘发作30min为止。激发前30min给予腹腔注射苯海拉明5mg/kg，防止豚鼠严重哮喘发作而死亡，48h后行支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL）。正常组:按哮喘组方法，用苯海拉明预处理动物后，用生理盐水代替2%OA进行激发，48h后行BAL。各处理组:按哮喘组方法处理动物。用卵蛋白激发24h后，用地塞米松10mg/kg或雷公藤甲素40μg/kg或氨茶碱100mg/kg豚鼠腹腔注射，24h后行BAL。
1.3 主要方法
1.3.1 支气管肺泡灌洗 经颈动脉放血处死动物后，立即用Hanks液经气管注入5ml×3次，轻轻按摩动物的胸部20～30s后回收BAL，回收率>90%。
1.3.2 细胞计数及分类 全部BAL液400g×10min，4℃离心，收集沉淀的细胞，重悬于Hanks液中。进行Eos绝对计数。取数滴BAL液至玻片上，行细胞分类。
1.3.3 嗜酸细胞分离 参照文献 ［2］ 配制不同比重的perˉcoll液。在5ml离心管中依次加入1.105、1.090、1.080的percoll液各1ml，最后加入上述细胞悬液1ml。用960g×15min20℃离心。离心完毕后，分别回收不同比重交界面的细胞层。用嗜酸细胞稀释液计不同比重的嗜酸细胞绝对数。调整细胞数5×10 6 /ml，取1ml行RT-PCR。少许细胞涂片行原位杂交及凋亡检测。
1.3.4 寡核苷酸探针合成 参照文献 ［3］ 由中国科学院上海细胞生物研究所合成，PAGE纯化，纯度>99%。bcl-2:3′GAC AAA CTA AAG AGG ACC GA5′。
1.3.5 寡核苷酸探针标记 地高辛（Dig）标记使用3′末端转移法，其原理是利用3′末端转移酶将带有Dig基团的ddUTP掺入寡核苷酸探针3′末端的游离羟基上。操作方法参照试剂盒说明进行，主要步骤如下:取EP管依次加入探针100pmol、标记缓冲液4μl、CoCL 2 4μl、Dig-ddUTP1μl、TdT1μl、ddH 2 O5μl，37℃孵育10min，4℃过夜。加2μl糖原终止反应。以2.5μl4MliCL及75μl预冷的乙醇充分混匀，- 20℃2h。12000g离心10min，弃上清，70%乙醇50μl漂洗，空 干，加双蒸水20μl，-20℃保存。标记效率>90%。
1.3.6 原位凋亡细胞检测 TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法。参照试剂盒说明书进行。荧光显微镜下观察摄影。
1.3.7 原位杂交 参照蔡文琴 ［4］ 方法进行。设两种阴性对照:（1）以不加探针的杂交液进行杂交孵育。其余步骤相同。（2）标记IL-5Rα正意链，序列如下:5′GCC CTT TGA TCA GCT GTT CAG TCC AC3′。标记方法同上述探针标记法。杂交时以此标记正意链进行杂交。所有的操作步骤与其它样本相同。
1.4 统计学分析 Eos凋亡及bcl-2 + 细胞在光镜下随机观察5个视野，计数200个细胞以上，计算阳性细胞百分率。所有数据以SPSS（Statistics Package for Social Science）统计分析。各组结果以均数±标准差（ˉx±s）表示，采用非配对t检验，P<0.05为差异有显著性。P<0.01为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 DM、TP、AM对哮喘豚鼠Eos细胞凋亡的影响 哮喘组Eos凋亡率较正常对照组明显降低（P<0.01），应用DM、TP、AM后均显著增加（P<0.05），低密度Eos与正常密度Eos比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。
2.2 DM、TP、AM对哮喘豚鼠肺组织及BALF Eos bcl-2表达的影响 原位杂交显示:BALF中不同密度Eos bcl-2mRNA表达，哮喘组明显高于正常组（P<0.01）;DM、TP处理组显著低于哮喘组（P<0.01），AM组Eos表达bcl-2与哮喘组差异无显著性。各组中HEos与NEos相比，差异无显著性（P>0.05）。见表2。
表1 DM、TP、AM对哮喘豚鼠BALF中Eos细胞凋亡的作用 〔略〕
表2 DM、TP、AM对哮喘豚鼠BALF Eos bcl-2表达的影响 〔略〕
3 讨论
嗜酸细胞聚集及活化是许多过敏疾病的特征。活化Eos细胞毒产物引起细胞损伤，导致组织炎症。细胞凋亡后可被巨噬细胞完整吞噬，从而加速炎症清除。炎症细胞也可通过选择性自我损伤而加速在组织中的清除。bcl-2为一抑制细胞凋亡的原癌基因。它在维持免疫系统功能、调节肾脏等组织器官发育等多方面发挥重要作用。bcl-2表达异常与许多疾病有关。哮喘患者支气管活检标本中的bcl + 细胞明显高于气管炎患者及对照组 ［5］ 。本研究发现正常豚鼠Eos可表达bcl-2mRNA，哮喘时明显增加，HEos与NEos相比差异无显著性，进一步证明Eos表达bcl-2增加 是哮喘时Eos凋亡障碍的原因之一。哮喘时bcl-2增加的原因可能为:（1）IL-5、IL-3等细胞因子增加。有研究表明哮喘时IL-5等细胞因子表达增加，细胞因子可直接诱导bcl-2表达。用bcl-2的反意寡聚核甘酸可明显抑制IL-5引起的Eos存活，而对IFN-γ无明显影响。从人细胞因子依赖的红白血病细胞株TF-1去除IL-3后，在8～24h内bcl-2mRNA及蛋白水平下降，随之凋亡开始。通过8～18h的细胞因子脱除，70%～80%的细胞进入了凋亡。用蛋白激酶C（PKC）抑制剂可以下调bcl-2的表达。表明IL-3通过激活蛋白激酶C在维持bcl-2中起重要作用 ［6］ 。（2）IL-5、IL-3等细胞因子膜型受体增加、功能增强及可溶型受体减少。受体增加后，信号传导增强，IL-3等细胞因子作用增强，通过蛋白激酶C调节bcl-2的表达。可溶型受体减少，细胞信号负调节减弱，同样可加强细胞因子作用，间接提高bcl-2的表达。（3）内源性NO减少，同样可增加bcl-2的表达，可能是通过ERK（细胞外信号调节蛋白激酶）或p38MAPK（丝裂素活化蛋白激酶）途径 ［7］ 。最近研究发现bcl-2可通过CD69抑制细胞凋亡，与广泛存在的CD95相比，CD69局限在Eos中，是治疗哮喘理想的靶目标 ［8］ 。
用DM、TP治疗后，无论HEos还是NEos表达bcl-2均明显下降，两组治疗相比差异无显著性，AM对Eos表达bcl-2影响不大，而AM对细胞凋亡的影响明显比DM弱，表明DM及TP治疗哮喘，促进Eos凋亡，bcl-2在其中发挥重要的作用，bcl-2并不是调节细胞凋亡的唯一通路。茶碱可以通过调节bcl-2及细胞内cAMP水平促进Eos凋亡 ［9］ ，我们也发现AM在体外可以抑制Eos表达bcl-2，从而促进凋亡，但在体内抑制不明显，表明AM促进Eos细胞凋亡可能主要通过Fas、Bax等其它途径 ［10］ 。糖皮质激素是治疗Eos增多包括哮喘的最有效的抗炎药，研究发现激素主要通过以下途径抑制Eos炎症:（1）抑制Eos生存因子的合成及作用，Wallen等发现IL-5、IL-3及GM-CSF介导的人Eos存活可被皮质激素阻止 ［11］ 。表明激素竞争性阻滞Eos活动性细胞因子的作用。（2）直接引起Eos凋亡，地塞米松结合Eos上的糖皮质激素受体，相互作用，加速凋亡，促进炎症的清除。（3）刺激吞噬细胞的吞噬 ［12］ 。（4）激素调整Eos的死亡通过影响不同的凋亡信号，包括bcl-2的活动，本研究也证实了这一点。TP具有抑制哮喘气道高反应性的作用，对Eos的活性也有抑制作用。本研究证实TP可以促进Eos凋亡，其作用与DM相比差异无显著性。表明TP可能通过促进Eos凋亡来抑制细胞活性。这是TP降低气道反应性的机制之一。TP可抑制哮喘豚鼠不同密度Eos表达bcl-2，可能是其促进Eos凋亡的机制之一，TP不属于激素类，这在治疗激素依赖性哮喘中有重要意义。
总上所述，哮喘时Eos凋亡减少，导致肺内Eos增加，Eos bcl-2表达增多可能是哮喘时Eos凋亡减少的原因之一，DM、TP及AM可促进哮喘肺组织中的Eos细胞凋亡，bcl -2可能是DM及TP调节Eos凋亡的重要途径之一。
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作者单位:1 710032西安第四军大学西京医院呼吸内科
2 重庆第三军大学新桥医院呼吸病研究所