基因芯片技术在心血管病研究中的应用与思考

　　随着分子生物学相关学科技术的迅猛发展，以及人类基因组序列的测定完成，更促进了一些基因芯片技术的迅速形成，成为医学生物学中的重要研究手段之一。目前，已广泛应用于医学各学科中，如在基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析以及疾病的诊断、治疗和预防、药物筛选、基因测序等均发挥着重要的作用 ［1］  。自1999年基因芯片技术进入心血管系统研究以来 ［2，3］  ，已取得了较大进展。本文就近年来基因芯片技术在心血管病中的中西医基础研究进行分析与应用思考。
    
　　1 心血管疾病基因芯片
   
　　心血管病发生的特异基因和其基因芯片技术的研究，是近年来该领域研究的热点和难点之一。华裔科学家、美国哈佛大学刘宗正教授在北京阜外心血管病医院演讲时宣布，他们已经确定与心脏衰竭等心血管疾病有关的26000多个基因———也是世界上首次找到系统疾病的致病基因，已经运用1万个左右与心血管疾病有关的基因制成基因芯片。但制成基因芯片后，能够作为诊断心血管疾病的有力工具，还需要进行更多的基因流行病学研究，才能找到特定疾病与基因间的关系。同时，由于心脏病的发生几率较高，并且引起心脏衰竭的病原较多，主要包括心肌炎、高血压、糖尿病、心肌梗死、缺氧等，因此，现在虽然已经找到200多个与心脏衰竭有关的病态基因，但需要进一步分析这些基因与哪些病原有关 ［4］  。可见基因芯片技术在心血管病中的应用，仍需大力研究。
   
　　2 心脏发育过程中的基因表达谱变化
   
　　了解正常动物发育过程中心脏的基因表达谱情况及其意义，对心脏疾病的诊断、治疗等有重要的价值。目前，这类研究较少。Sehl等 ［5］  比较了出生13天的胎鼠和出生后1天的乳鼠的基因表达谱。结果表明，在发育过程中，大鼠心肌ANP、BNP、osteopontin、Ⅲ型胶原、fibronetin等基因的表达发生了改变，而在心肌缺血损伤重塑过程中，这些基因也有类似的表达改变。李平等 ［6］  应用超声心动术检测8、10、12周龄Wistar大鼠的心脏结构和功能指标，应用cDNA基因芯片技术观察心脏基因表达水平的变化，观察了大鼠发育成熟过程中心脏生长与心脏基因表达谱变化的关系。显示大鼠从8周龄生长至12周龄，体重增加约45.7%，前2周和后2周增加幅度相近。心脏左心室重量和室壁厚度分别增加约27.7%和23.6%，前2周增加幅度明显大于后2周。基因表达谱的改变涉及细胞结构、代谢、氧化应激及信号转导等多方面的基因。10周龄和8周龄大鼠比较，变化的基因多数上调;12周龄和10周龄大鼠比较，基因表达谱基本又返转至8周龄水平。表明，大鼠在成长期的4周内（8～12周龄），左心室基因表达谱发生的变化适应生理性心肌生长需要。由于目前对大鼠出生后心脏生长发育的研究多为胚胎、新生、成年和老年之间的比较，而对于接近成熟期的短期内心脏结构和基因表达变化的研究尚未见报道，因此，对这些问题的证实需要进一步的深入研究和进行系统分析，进而确定心脏发育过程中的基因表达谱的变化及其意义。
   
　　3 不同原因所致心肌损伤重塑过程中的基因表达谱变化

　　心血管系统生理功能和病理改变的分子机制十分复杂，由于该系统除由心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、神经细胞等多种细胞构成外，尚有较多的如血管紧张素受体、α、β肾上腺素受体、乙酰胆碱受体等交互作用的信号分子，同时也包括血流等在内的各种因素的影响。因此，在揭示其损伤重塑机制时，需借助多环节、多层次的理论和方法来完成。目前，在心脏的研究中基因芯片技术主要用于检测心肌重塑模型（包括缺血损伤、拟神经递质/激素刺激造成的心肌重塑和不同发育阶段的心肌重塑等模型）的基因表达谱［7］  。此仅从手术、药物、缺血缺氧、运动及糖尿病等所致心肌损伤重塑过程中的基因多态表达进行阐述。张幼怡等 ［8］  制备大鼠腹主动脉缩窄造成心脏肥厚模型，观察不同发展阶段的基因表达谱情况。在腹主动脉缩窄手术2周、4周和6周3个阶段中，基因表达水平连续发生变化的基因较少，只有心钠素前体（ANF）和几个EST，而多数基因表达水平的变化仅出现在某一个特定阶段。缩窄手术2周后，表达发生变化的基因相对较多。这些基因涉及的功能非常广泛，包括维持细胞结构、影响细胞代谢、介导细胞信号转导等。其中，能改善血液纤溶状态的尿激酶、具有抗氧化功能的超氧化物歧化酶SOD 3 和参与心肌细胞脂肪酸β氧化的长链酰基辅酶A表达下降，心肌细胞骨架蛋白TNT 2 的表达也发生下调，而提示心脏纤维化的细胞外基质Ⅰ型胶原和参与细胞增殖的转录因子p105表达升高。 在缩窄手术后4周和6周，上述基因表达水平的变化都恢复到正常水平。但在这两个时期，又产生了新的基因表达水平改变。如在缩窄手术后4周，非心肌细胞骨架蛋白smooth muscle actin的表达发生了上调，亚铁血红素氧化酶的表达则发生了下调;而在缩窄手术6周后，PKC zeta、CyP450IIA3和脂肪酸氨基水解酶等基因的表达发生明显的下调。此外，通过缓释微泵连续输注去甲肾上腺素可以引起明显的心肌肥厚。随着去甲肾上腺素的持续输注，大鼠左心室重量和心脏指数逐渐增加，并在输注3天后达到高峰，而后稍有下降。在去甲肾上腺素持续作用下，心肌细胞基因表达谱发生了明显的变化。以参与能量代谢的肉毒碱八酰基转移酶、脂酶和糖原磷酸化酶为例，它们的表达变化模式较为相似。去甲肾上腺素输注早期其表达明显增高，而后逐渐下降，提示在心肌肥厚早期，心肌细胞通过增强脂肪酸代谢和抑制葡萄糖代谢来增加能量的产生，以适应高儿茶酚胺的病理性刺激。而心肌肥厚标志性基因心钠素前体的表达水平变化则与上述基因完全不同，其表达变化模式与心肌肥厚的进程一致，在心/体比达到最大时表达水平升至最高。此外，当心肌肥厚发展到最高峰时，参与信号转导和神经递质代谢的物质基因表达水平多发生变化，提示此时心肌细胞生物活动旺盛，以适应病理刺激。值得指出，去甲肾上腺素输注3天和7天后，分别引起PI3Kinase和P53基因表达的增强。
   
　　缺血、缺氧是烧伤、创伤、手术、休克等多种病理条件下组织细胞损害的基本原因之一。然而不同组织细胞对缺血、缺氧反应的敏感性不同。王水明等 ［9］  探讨严重缺氧后心肌细胞损害敏感性的分子机制。其以包含4096条小鼠基因的DNA芯片，检测严重缺氧6h的大鼠心肌和骨骼肌细胞之间的差异表达基因。结果显示严重缺氧6h后，125条基因在骨骼肌细胞中高表达，111条基因在心肌细胞中高表达。其中，编码凋亡活化因子Mtd、补体C 3 、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、β-整合素及脂多糖结合蛋白（LBP）等的基因在心肌细胞中高表达。表明严重缺氧6h后，凋亡活化及炎症介质的产生在心肌细胞敏感性损害中发挥着重要作用。
   
　　有比较正常大鼠和糖尿病性心肌病大鼠心肌组织中基因表达的差异，探讨糖尿病性心肌病的发病机制。结果显示:氧化应激相关基因和能量代谢相关基因的表达水平在糖尿病性心肌病时明显下调;S腺苷蛋氨酸合成酶和精氨酸酶的表达水平在糖尿病性心肌病时明显上调。说明氧化应激和能量代谢障碍在糖尿病性心肌病发病机制中起重要作用;S腺苷蛋氨酸合成酶、精氨酸酶通过影响糖尿病性心肌病大鼠心肌组织中同型半胱氨酸、一氧化氮的含量在糖尿病性心肌病发病机制中起重要作用 ［10］  。
   
　　田振军等 ［11］  利用基因多态性检测应用cDNA基因芯片对安静对照组和运动性心肌肥大组小鼠心肌组织的基因表达差异进行筛选，具有显著性表达差异的基因有71条，其中上调表达的基因有37条，下调表达的基因有34条，这些基因包括肿瘤相关基因、细胞骨架蛋白基因、代谢相关酶的基因、酪氨酸磷酸酶基因、心肌结构蛋白基因等多种多基因家族编码的基因。因此认为，运动性肥大心肌是由多基因编码调控，并与细胞代谢、神经体液因素的调控以及心肌收缩蛋白和非收缩蛋白的合成共同参与有关，进一步证实了运动性心肌肥大相关基因的多样性。应用cDNA基因芯片可有效地对运动与心血管结构与功能的变化机制进行更深一步的研究，cDNA芯片技术筛选运动性心肌肥大相关基因具有高通量、高敏度、高效率、大规模和并行性等优点。

　　4 基因芯片技术揭示中医药治疗心血管病的机理研究
   
　　基因芯片技术在中医药研究中，亦有从证的研究、复杂的作用机理研究、有效药物筛选及中药新药研发等进行了探讨，但多局限于研究思路和拟采用的方法学上，具体研究中存在一些技术上问题，理论和方法尚未成熟，仍处于摸索阶段 ［12］  。目前，基因芯片技术在中医药治疗心血管病研究报道为少，王硕仁教授负责的研究项目 ［13］  ，利用结扎大鼠左冠状动脉造成心梗后心衰模型，对心衰形成期（术后10天）、稳定期（术后8周）的大鼠左心室梗塞区、非梗塞区和同期假手术组左心室分别取材，进行了相关检测，并观察了益气活血复方的作用。发现心衰模型大鼠心肌有参与能量代谢、心肌细胞骨架及纤维等13类共千余条表达上调和下调的基因，在梗塞区差异表达基因形成期最多（1086条）、稳定期次之（724条）;而非梗塞区为形成期最多（196条），稳定期较少（97条）。说明心梗后心衰是一种多基因病;益气活血法可能通过对心梗后心衰大鼠心脏能量代谢相关基因的调节而改善其功能，起到治疗心衰的作用。此外，有学者制备了包含87个心血管疾病相关基因探针的寡核苷酸芯片。将知母皂苷作用8h及未作用的培养人血管内皮细胞提取总RNA，通过逆转录分别标记Cy5和Cy3荧光染料，然后与芯片杂交，检测知母皂苷对血管内皮细胞中心血管疾病相关基因表达的影响。显示知母皂苷作用于血管内皮细胞后，血管紧张素酶原（AGT）基因、肾上腺素α2A受体基因和内皮素转换酶1基因的表达均有不同程度的下调。说明知母皂苷有调控血管内皮细胞功能的作用，可能是其治疗心血管疾病的机制之一 ［14］  。可见基因芯片技术可以用于中药作用机理的研究，特别是其高通量、多态性等特点可能有助于解决中药作用多靶点的一些问题。但通过对已研究的资料进行分析，具体的基因调控、基因鉴定及其意义，应进一步深入分析与研究。
   
　　综上所述，通过对近年来基因芯片技术在心血管病研究特别是国内的应用研究分析，存在一些问题，值得思考。如（1）基因芯片的特异性有待提高。研究论文体现了多种原因均可使不同的大量基因上调或下调，但这些基因的特异性如何，有待进一步鉴定。（2）基因分析方法研究需要加强。如何利用数理等分析方法，进行对上调或下调基因进行分析，进而筛选出有价值的基因，是一份重要的工作。（3）模型动物基因组研究有待加强。形成标准的基因谱，将对心血管病的诊断、治疗及药物筛选有重要意义。此外，在样品制备简单化、检测方法标准化等应进行深入研究，亦是今后研究的重点。相信不久的将来基因芯片技术能够更好的、更广泛的应用于心血管病的研究中。

　　参考文献
    
　　1 王佚.基因芯片技术及其在医学研究中的应用.重庆医科大学学报，2002，27（4）:506-508.
   
　　2 Shimket R，Lowe D，Tai J，et al.Gene expression analysis by transcript profiling coupled to gene database query.Nat Biotechnol，1999，17:798-803.
   
　　3 Feng Y，Yang J，Huang H，et al.Transcriptionnal profile of mechanically induced genes in human vascular smooth muscle cells.Circ Res，1999，85:1118-1123.
   
　　4 刘宗正.心血管疾病基因芯片制成.中国心血管杂志，2002，7（3）:173.
   
　　5 Sehl P，Hillan K，Brown L，et al.Application of cDNA microarrays in determining molecular phenotype in cardiac growth development，and reˉsponse to injury.Circulation，2000，101:1990-1999.
   
　　6 李平，李劲梁，候嵘，等.大鼠成长期左心室基因表达谱的变化.生理学报，2003，55（2）:191-196.
   
　　7 李劲梁，李平，张幼怡.基因芯片技术在心血管研究中的应用.北京大学学报（医学版），2001，33（4）:295-297.
   
　　8 张幼怡，韩启德.心脏重塑时基因表达谱改变及基因调节网络的初步研究.北京大学学报（医学版），2002，34（5）:585-589.

　　9 王水明，刘友生，陈锐.严重缺氧后心肌细胞损害敏感性的分子机制.中华烧伤杂志，2003，19（3）:134-136.
   
　　10 陈刚，林丽香，庄维特，等.用基因芯片技术研究糖尿病性心肌病大鼠心肌组织的部分基因表达谱.中华心血管病杂志，2002，30（8）:493-495.
   
　　11 田振军，张志琪，唐量，等.应用cDNA生矩阵基因芯片筛选运动性心肌肥大相关基因的初步研究.中国运动医学杂志，2002，21（2）:122-126.
   
　　12 郭书文，孟庆刚，王国华，等.基因芯片技术在中医药研究中的应用探讨.中国中医药信息杂志，2004，11（11）:946-949.
   
　　13 陈金星，王硕仁，秦英，等.心梗后心力衰竭大鼠心脏基因表达谱及益气活方对其血流动力学影响的研究.北京中医药大学学报，2003，26（5）:31-34.
   
　　14 李泽松，李德良，黄坚，等.心血管相关基因芯片的制备及其在知母皂苷作用机理研究中的应用.药学学报，2003，38（7）:496-500. 

　　ˇ 基金项目:国家自然科学基金资助项目（批准号:90209021）
   
　　作者单位:100029北京中医药大学