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Key words asthma Th 1 Th 2 tryperygium polyglycoside
支气管哮喘（简称哮喘）是一种由T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和中性粒细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病。T辅助淋巴细胞（Th）亚群的发现及其在哮喘发病中的重要作用，为揭示哮喘的本质，进一步开展发病机制的研究有重要意义。1986年，Mosmann等发现小鼠的CD4 + T细胞株按产生细胞因子的类型和生物功能，可分为Th 1 和Th 2 两种亚型。1991年，Maggi等发现人类也有类似小鼠的Th 1 和Th 2 细胞。Th 2 细胞主要分泌IL-4和IL-5。IL-4具有促进肥大细胞的生长 ［1］ ，促进IgE的合成的作用 ［2］ ;IL-5的作用是促进嗜酸性粒细胞的分化 ［3］ 、粘附 ［4］ ，通过抑制嗜酸性粒细胞的凋亡来延长嗜酸性粒细胞的寿命 ［5］ 。在Th 2 细胞占优势时，易于发生高IgE血症和嗜酸性粒细胞的增多，因此，Th细胞可能是哮喘发病中的重要环节或始动因素。本试验采用酶联免疫斑点法在单个细胞水平上测定细胞内细胞因子的产生来研究Th 2 细胞和Th 1 细胞平衡的变化，探讨Th失衡与哮喘发病的关系以及雷公藤多甙治疗对哮喘患者Th 1 /Th 2 细胞平衡的调节作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2000年10月～2003年12月期间在我科门诊或病房就诊的哮喘患者共40例，所有病例诊断均符合全国哮喘会议制定的“哮喘急性发作期分度诊断指标”诊断 ［6］ 。其中男23例，女17例，男女之比为1.4:1。年龄21～56岁，平均41岁。病程0.5～30年，平均27年。所有患者治疗前都做了肺功能检测，FEV 1 均有不同程度的降低，平均为（2.75±0.42）L/min。所有患者均未接受GINA方案的正规治疗。其中轻度29例，中度11例。另选取40例健康体检者作为对照组，排除过敏性疾病。
1.2 方法
1.2.1 治疗方法 40例病人口服雷公藤多甙20mg，每日3次和凯宝川宁0.2g，每日2次（茶碱类缓释胶囊），治疗4周。按需吸入β 2 -激动剂，是由重庆葛兰素公司生产的沙丁胺醇（万托林）气雾剂。于治疗前和治疗4周后分别抽取外周静脉血。
1.2.2 实验方法
1.2.2.1 细胞孵育刺激 静脉采血1ml，肝素抗凝，与DMEM培养基1:1混匀，加入刺激原PMA（20μg/ml）、离子霉素（1μg/ml）作刺激原，同时加入蛋白质转运抑制剂monˉensin（2μg/ml），37℃，5%CO 2 孵育4～8h。
1.2.2.2 表面抗原标记 细胞孵育后取200μl加红细胞裂解液，将红细胞完全裂解，离心1000r/min×5min，弃上清，分别加入Cy-chrome标记的鼠抗人CD4、CD8、CD3单抗20μl室温避光45min。
1.2.2.3 膜固定 2%多聚甲醛固定20min。
1.2.2.4 破膜打孔，细胞内标记 0.1%皂素缓冲液破膜，抗IL-4、IFN-γ单抗标记30min，缓冲液清洗、离心，弃上清，用500μl PBS和1%多聚甲醛悬浮细胞。
1.2.2.5 流式细胞术检测 流式细胞仪激发光为氩离激光488nm谱线，以前向散射光及倒向散射光“开窗”于淋巴细胞群体，各荧光通道均以相应同种型IgG染色细胞为阴性对照，每一样品检测20000个细胞，数据分析使用Lysis软件。
1.3 统计学方法 t检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
临床观察表明，随治疗时间的延长，患者哮喘发作次数逐渐减少，每次发作的程度也逐渐减轻，沙丁胺醇气雾剂的用量逐渐减少。有1例因哮喘发作较重而未能尽快控制而退出。雷公藤多甙治疗前后细胞内IL-4、IFN-γ表达率见表1。
表1 雷公藤多甙治疗前后细胞内IL-4、IFN-γ表达率 （略）
注:与治疗后比较 ① P>0.05， ② P<0.01;与对照组比较 ③ P>0.05
由表1可知雷公藤多甙治疗前、后相比Th 1 细胞百分比差异无显著性（P>0.05），Th 2 细胞显著下降（P<0.01），治疗前后Th 1 /Th 2 比值相比差异有非常显著性（P<0.01）。治疗后Th 1 、Th 2 细胞百分比、Th 1 /Th 2 比值与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。
3 讨论
1989年Mossman根据Th细胞分泌细胞因子的不同将其分为两个功能亚群即Th 1 /Th 2［7］ ，Th 1 细胞主要产生IL-2，IFN-γ等，它可作用于迟发型超敏反应和提高细胞毒反应，同时也可抑制过度的Th 2 反应，从而降低IgE应答。Th 2细胞主要产生IL-4，IL-5和IL-10等，体外试验表明IL -4在抗体生成，特别是促进B淋巴细胞合成IgE，促成过敏反应中起了很大作用 ［8］ 。
正常情况下Th 1 与Th 2 细胞之间处于平衡状态。Tang ［9］ 报道特应质患儿外周血单个核细胞产生IL-4明显升高，IFN-γ明显降低，这两种细胞因子失调程度与疾病严重程度及IgE水平呈正相关。Moverare等分离季节性过敏性鼻炎和结膜炎患者外周血T淋巴细胞，细胞培养上清液中IL-4、IL-5浓度显著高于正常对照组，IFN-γ则显著低于对照组，表明特异性过敏原对相应的过敏性疾病患者Th细胞增殖有明显的选择性，过敏原激活淋巴细胞，使其由Th 0 、Th 1 型向Th 2 型转化，Th 2 细胞优势分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子，导致炎症效应细胞如肥大细胞、嗜酸性粒细胞的聚集和激活 ［10］ 。
Th 1 和Th 2 细胞在体内通过分泌不同的细胞因子促进自身的发展，抑制对方的发展。Th 1 细胞分泌IFN-γ可抑制Th 2 的增殖 ［11］ ，促进自身的增殖 ［12］ ，Th 2 细胞分泌的IL-4可以促进自身的增殖 ［13］ 。Akiyoshi等 ［14］ 通过检测患者的BALF，发现在稳定期哮喘患者中，Th 2 细胞在支气管局部炎症区积聚，当吸入过敏原时，释放IL-4和IL-5，导致哮喘发作。Robinsin等 ［15］ 对15例过敏性哮喘患者和10例正常人的BALF进行分析，发现在哮喘患者的BALF中IL-4和IL5的mRNA表达明显高于对照组，而IFN-γ在两组间无明显差异，说明在哮喘患者的BALF中Th 2 细胞占主要地位。由于这些细胞因子不只是由Th 2 细胞和Th 1 细胞产生，如嗜酸性粒细胞和肥大细胞也可以产生IL-5 ［16］ 。因此BALF和静脉血中的IL-4、IL-5或IFN-γ的水平不能准确代表Th 2 细胞和Th 1 细胞。采用流式细胞技术，对T淋巴细胞表面进行标记，同时细胞膜打孔，特异性的单克隆抗体对细胞内细胞因子进行标记，得到群体细胞中的每个细胞多参数的生物学特征，对单个细胞进行细胞内细胞因子定性、定量分析，能够准确客观地反映细胞的功能状态和细胞因子的来源。Th细胞最先在CD4 + T细胞中发现，故检测CD4 + T细胞中IFN-γ/IL-4阳性分泌细胞应该更能反映Th细胞亚群的变化。
实验结果显示，与正常组比较，哮喘组静脉血中的Th 1 细胞数降低，而Th 2 细胞数明显升高，Th 1 /Th 2 比值明显下降，说明在哮喘患者Th亚群失衡，使原来偏向于Th 1 的平衡向Th 2 方向转变，引起Th 1 相对减少Th 2 相对增加，从中可以确定Th亚群之间的失衡在哮喘发作中起着重要的作用;所以Th 1 /Th 2 的比值改变更能代表哮喘的发病时的真实情况。雷公藤多甙因其良好的抗炎与免疫调节作用而在临床上广泛用于治疗变态反应性与自身免疫性疾病。已经在临床上用于难治性哮喘治疗，取得了较好疗效。来茶云等 ［17］ 用雷公藤治疗哮喘患儿，发现能改善哮喘症状和气道阻塞。但是雷公藤治疗哮喘的机理尚不清楚。本试验选取雷公藤多甙进行研究，发现哮喘大鼠经雷公藤多甙治疗后，与哮喘组比较，静脉血Th 1 /Th 2 的比值明显上升（与治疗前比较，P<0.01）。说明雷公藤多甙对Th亚群平衡有一定的影响，使Th 1 升高，Th 2 降低，从而使Th亚群平衡向Th 1 方向转变。其免疫调节和抗炎的机制主要有:（1）调节T细胞亚群的功能;（2）抑制抗体的产生;（3）抑制细胞因子及炎性介质的合成与释放;（4）抑制磷脂酶A 2 的作用而产生抗炎及免疫调节作用 ［18］ ，雷公藤多甙对哮喘的治疗可能是通过影响Th亚群的平衡来实现的，其具体机制还有待进一步研究。
总之，哮喘病人，静脉血Th 1 /Th 2 比值明显降低，而经过雷公藤多甙治疗后，静脉血Th 1 /Th 2 比值明显升高。本观察未发现其毒副作用。因此Th亚群的平衡变化在哮喘发病机制中起着十分重要的作用，雷公藤多甙治疗哮喘的机制与改变Th群的平衡有关。
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作者单位:637000四川南充川北医学院附属医院呼吸内科