四种结核杆菌检测方法对肺结核病的诊断价值

　　结核病是一种较严重的传染病，目前的疫情呈上升趋势。检出痰中含有结核杆菌是临床诊断肺结核或鉴别肺结核与其他肺病的重要依据。痰中结核杆菌的检测方法常规采用痰涂片及痰培养。涂片虽简单易行，但阳性率低，培养虽为金标准，但周期太长，均难以满足临床需要。近年来，一些针对结核分支杆菌检测的新方法陆续报道。本文对聚合酶链反应（PCR）法、噬菌体裂解法、斑点杂交法、PCR-斑点杂交法，四种结核分支杆菌检测方法的应用进行评价。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 肺结核组121例肺结核病住院患者（经临床确诊），其中痰菌涂片阳性者49例，涂阴者72例。非结核肺疾病组54例，他们中间慢阻肺者9例，上呼吸道感染者21例，肺炎20例，其它疾病4例。

　　1.2 检测方法
   
　　1.2.1 PCR法 华美公司生产结核杆菌PCR检测试剂盒（电泳法），按说明进行操作。
   
　　1.2.2 噬菌体裂解法 试剂:英国BIOTEC公司结核杆菌检测试剂盒（FAST Plaque TB  TM  ）。方法:按操作规程进行实验及结果判定。
   
　　1.2.3 斑点杂交法 PCR法制备地高辛标记的探针INS-1（5′CGTGAGGGCATCGAGGTGGC）和INS-2（5′GCGTAGˉGCGTCGGTGACAAA）为引物，以BCG的DNA为模板，以dUTP-Dig:dTTP=3∶1代替反应体系中的dTTP的量。
   
　　（dUTP-Dig:Roche公司），经PCR扩增，得到地高辛标记的 245bp探针 ［1］  。
   
　　标本前处理，标本加入1～2倍体积NoAc溶液，液化20min，90℃水浴30min，离心去上清，向沉淀中加入溶菌酶（promega公司）30min，加入SDS/蛋白酶K20min。
   
　　取3μl点膜，晾干;碱变性5min，80℃烘干10min;加入变性的探针进行杂交，42℃3h。杂交后洗膜加入anti-Dig-Ap（Roche公司）与探针上标记的地高辛反应。采用发光自显影技术（CDP-star:Roche公司）检测杂交带。
   
　　1.2.4 PCR-斑点杂交法 痰标本经PCR扩增后，用斑点杂交方法进行标记探针的杂交检测。

　　2 结果
   
　　2.1 几种检测方法的敏感性实验 结核杆菌菌液分别配制不同浓度（Mcfarland3.0浊度相当于细菌浓度10 7 cfu/ml）进行四种方法检测结核杆菌。PCR法、斑点杂交方法、PCR-斑点杂交法、噬菌体裂解法检出最低浓度分别为50、5×10 2 、20、5×10 2 cfu/ml。
   
　　2.2 PCR法对涂阳、涂阴、非结核病标本的检出率 分别为89.8%、29.2%、1.9%;斑点杂交法的检出率分别为81.6%、9.7%、0;PCR-斑点杂交法的检出率分别为98.0%、43.1%、1.9%;噬菌体裂解法的检出率分别为93.9%、23.6%、0;PCR法、斑点杂交法、PCR-斑点杂交法、噬菌体裂解法检测结核杆菌其灵敏度分别为53.7%、38.8%、65.3%、52.1%，特异度分别为98.1%、100%、98.1%、100%。见表1。

　　表1 四种方法检测结核杆菌的结果（略）
   
　　3 讨论
    
　　对于肺结核的实验室诊断，涂片找抗酸杆菌还是最普及和经济的方法，但其阳性率很低（30%左右）。结核杆菌培养仍是目前诊断MTB的金标准，尤其是药敏实验结果在指导临床用药及耐药性监测等方面具有重要作用，但其耗时太长则有待改进。
   
　　PCR法、斑点杂交法、PCR-斑点杂交法、噬菌体裂解法检测结核杆菌其敏感性分别为40、10 3 、20、3×10 2 cfu/ml，检测浓度均低于痰涂片的检测浓度（5×10 3 cfu/ml）。
   
　　PCR法检测结核杆菌其灵敏度为53.7%、特异度为98.1%。该方法具有敏感性高、诊断速度较快等优点，但还存在一定程度的不稳定性 ［2］  。本文中出现一例假阳性，可能是标本内抑制物引起或标本、试剂污染所致。斑点杂交法检测结核杆菌其灵敏度为38.8%、特异度100%;PCR-斑点杂交法检测结核杆菌其灵敏度为65.3%，特异度98.1%。斑点杂交法直接检测临床标本，其灵敏度和敏感性均有待提高 ［3］  。而特异性强的DNA探针杂交与敏感性高的PCR技术相结合已成为结核病实验研究、诊断应用的一种良好途径。
   
　　应用噬菌体进行结核菌的研究亦开始起步，通过实验得出噬菌体裂解法检测结核杆菌其灵敏度为52.1%，特异度为100%。该方法为结核菌的检测和生、死菌的鉴别，特别是在结核菌药物敏感性实验上的应用开辟了一个新途径 ［4］  。本文中介绍的几种方法都具有较高的敏感性，对于结核病的诊断有较高灵敏度和特异度;随着这几种检测方法的不断成熟和完善，实验试剂的商业化，实验步骤的标准化，这几种方法有望成为结核病实验室诊断及鉴别诊断的有效方法之一。

　　参考文献
    
　　1 李书琳，韩中波，徐新顺，等.吉林市结核分支杆菌IS6110DNA指纹图谱特征分析［J］.中国防痨杂志，2002，24（6）:313-316.

　　2 ShanKar P，Manjunath N，MohanK K，et al.Rapid diagnosis of tubercuˉlosis Meninigitis by polymerase chain reaction［J］.The lancet，1991，237（4）:5-7.
   
　　3 张灵霞，庄玉辉，杨华卫，等.rDNA探针杂交检测病人痰标本中结核杆菌研究.中国防痨杂志，2000，22（3）:127-129.
   
　　4 刘志辉，罗一鲁.结核病实验诊断现状及展望.中国防痨杂志，2003，25（1）:38-40.

　　作者单位:132011吉林省吉林市结核病防治研究所