靶向抗癌药（As 2 O 3 ）前体脂质体的实验研究

　　【摘要】 目的  研究免疫脂质体的制备工艺，并检验其对靶细胞的特异性杀伤作用。 方法  采用超声法制备脂质体，通过正交设计筛选最佳配方，冷冻干燥法制备前体脂质体，戊二醛偶连CD33单抗制备免疫脂质体，并观察其对靶细胞及非靶细胞的作用。 结果  采用最佳配方时三氧化二砷平均包封率为98.3%。偶连CD33单克隆抗体后，对靶细胞（急性早幼粒细胞白血病M 3 亚型白血病淋巴细胞）杀伤率为40%，对非靶细胞（正常人外周血淋巴细胞）杀伤率仅为8%。 结论  免疫脂质体对靶细胞有特异性杀伤作用，而对抗原阴性细胞（非靶细胞）作用不大。
             
　　Preparation and targetibility of antitumor preliposomes entrapping arsenous oxide bearing monoclonal antibody
     
　　Fu Dahua，Zhu Liang
    
　　Department of Pharmacy，Jiangxi Medical University，Nanchang，Jiangxi330006.
   
　　【Abstract】 Objective To study the preparation technology of liposomes，and examine the peculiar toxicity of liposomes on targeting cellls.Methods Determining the entrapping rate of arsenous oxide in liposomes by new silver salt method，we studied the best preparing formula of liposomes by the orthogonal test design.The preliposomes which would made into immunoliposomes by conjugating monoclonal antibodies through glutaraldehyde were prepared from li-posomes by freeze-drying technology.And the peculiar toxicity of immunoliposomes on M3acute promyelocytic leukaemia lymphocytes was studied.Results The average entrapping rate of arsenous oxide in liposomes made in best formula is98.3percent.Using M3acute promyelocytic leukaemia lymphocytes as targeting cells and normal peripheral lymphocytes as control-group cells，we examined the peculiar toxitity of immunoliposomes on targeting cells and con-trol-group cells，respectively.The death rate of targeting cells is40percent，whereas that of control-group cells is only8percent.Conclusion Immunoliposomes are peculiar to their targeting-cells.
     
　　Key words arsenous oxide liposomes immunoliposomes targeting antitumor drugs acute promyelocytic leukaemia
      
　　目前，肿瘤已成为威胁人类生命健康安全的主要疾病之一，而化疗是治疗肿瘤的主要方法之一。但大部分化疗药物毒副作用比较大。本实验以As 2 O 3 为治疗药物，将As 2 O 3 包裹在免疫脂质体中，并研究免疫脂质体对靶细胞的特异性杀伤作用 ［1］ 。

　　1 实验材料
    
　　靶细胞:分离自急性早幼粒细胞白血病M 3 亚型初治病人骨髓血（骨髓血样由二附院血液科提供）;对照细胞:分离自正常人外周血。胆固醇（上海生物化学试剂公司）;卵磷脂（上海油脂一厂）;三氧化二砷（购自上海化学试剂采购供应站，CP）;CD33单克隆抗体（Cymbus Biotechnology，Exp:17-Nov-07）。
    
　　2 方法和结果
    
　　2.1 砷标准曲线的测定 分别取砷标准工作液（1μg/ml）0、1、2、3、4、5ml于砷化氢发生器中，加H 2 O至40ml，加入1+1硫酸10ml，15%KI溶液3ml，25℃水浴保温5min，再加入40%SnCl 2 溶液（新配制）1ml，25℃水浴保温15min后，加入无砷锌粒5g，反应1h，产生的气体以4ml吸收液吸收，测定各管吸收液之OD 410 。计算砷标准曲线，A=0.061+0.105C，r=0.991。在1～5μg浓度范围内，线性良好。
   
　　2.2 载药脂质体的制备 ［2］  卵磷脂、胆固醇溶于乙醚中，加入As 2 O 3 溶液，超声20min，即得载药脂质体。
   
　　2.3 包封率的测定 取脂质体1ml，无水乙醇破坏后稀释一定倍数，取1ml稀释液于砷化氢发生器中，同法测定OD 410 ，计算C和C 总 。
   
　　另取脂质体1ml，16，000rpm离心30min，分别取清液和悬浮脂质体，同法分别测定C，并分别计算C外和C 内 。包封率%=C 内 /（C 内 +C 外 ）×100%
   
　　2.4 空白回收率和加样回收率的测定 经测定，空白回收率为98.6%，加样回收率为97.8%。
   
　　2.5 处方筛选 为获得具有较高包封率的脂质体，重点考察了卵磷脂用量、As 2 O 3 用量、超声时间三因素三水平L 9 正交实验。以包封率为考察指标，筛选最佳配方。见表1。
     
　　经正交实验分析，得最佳配方为A 2 B 2 C 3 ，以该处方制备的脂质体，包封率为（98.3±2.6）%。各因素对包封率的影响大小依次为:因素2>因素1>因素3。

　　表1 L 9 正交实验表（略）
    
　　2.6 前体脂质体的制备 载药脂质体中加入适量甘露醇溶液，短时冰浴超声。冷冻干燥即得前体脂质体。
   
　　2.7 前体脂质体渗漏率的测定 取适量冻干粉末，测定As 2 O 3 包封率，则渗漏率%=1-E 冻干后 /E 冻干前 ×100%，渗漏率为10%。
   
　　2.8 脂质体的粒径 （苏丹Ⅲ染色，640×），大小约为1～2μm。见图1、图2。
   
　　2.9 免疫脂质体的制备 ［3，4］  前体脂质体水化后加入25ml25%的戊二醛溶液，室温下作用20min。于0.9%NaCl溶液中透析3h（中间换液一次）以除去过量戊二醛。加入CD33单抗100μg，于4℃冰箱中作用过夜。
   
　　2.10 免疫脂质体-游离单抗的分离 装Sephadex G-200柱（￠1.0cm×25cm），上样，收集免疫脂质体。
   
　　2.11 药物浓度梯度的设立 以0.9%生理盐水对倍稀释收集到的载药免疫脂质体（药物浓度分别为3.8，1.9，0.95，0.5μmol/ml）。
   
　　2.12 细胞毒性实验 ［3］  取M 3 初治病人骨髓血4ml，分离淋巴细胞，培养于含10%小牛血清的1640培养基中。设立空白对照组，阻断组及4个剂量组。每24h取样，苔盼蓝染色，计算细胞死亡率。MTT法测定各孔及本底OD 570 ，计算细胞存活率。
   
　　取正常人外周血4ml，分离淋巴细胞，培养于含10%小牛血清的1640培养基中，至对数生长期（72h）时，同法操作，计算细胞死亡率（苔酚蓝染色）和细胞存活率。见表3和表4。
    
　　表2 实验组和正常对照组细胞死亡率（略）

　　注: * P<0.01， ** P<0.05， *** P>0.05，与正常对照组比较 

　　表3 实验组和正常对照组细胞存活率 （略）
    
　　注: * P<0.01， ** P<0.05， *** P>0.05，与正常对照组比较
    
　　3 讨论
    
　　本实验中对苔酚蓝染色计算所得细胞死亡率和MTT法计算所得细胞存活率进行比较，发现转化为细胞存活率时，胎酚蓝法所得数据普遍小于MTT法所得数据，分析认为这是由于细胞受到药物作用后，细胞膜破溃，细胞形态破灭，无法计数。
   
　　游离单抗阻断实验结果显示:当实验组细胞用游离单抗阻断后，其细胞死亡率和MTT法计算所得细胞存活率与正常对照组无显著性差异。该实验结果反证了免疫脂质体对靶细胞的特异性杀伤作用。
   
　　可用免疫脂质体包裹钙黄绿素，并分别观察IL对靶细胞和对照细胞的作用。若在靶细胞中及其周围检测到较强的荧光强度，而在对照细胞中无此现象，且用游离单抗阻断靶细胞后，在靶细胞中及其周围亦检测不到较强的荧光信号，则可直观地证明免疫脂质体对靶细胞有特异性杀伤作用。

　　（本文图片见附页1）（略）
    
　　参考文献
    
　　1 Toshiro M，Toshiya H，Kazuo M，et al.Targetability and intracellular de-livery of anti-BCG antibody-modified，pH-sensitive fusogenic im-munoliposomes to tumor cells.International Journal of Pharmaceutics，2002，237:129-137.
   
　　2 徐梁，张学庸，樊代明，等.九种胃癌免疫脂质体的制备及其特性比较.中华医学杂志，1992，72（2）:101-102.
   
　　3 M Mercadal，JC Domingo，J Petriz.Preparation of immunoliposomes bearing poly（ethylene glycol）-coupled monoclonal antibody linked via a cleavable disulfide bond for ex vivo applications.Biochimica et Bio-physica Acta，2000，1509:299-310.
   
　　4 Alexander M，Owe O，Daniel T，et al.Rapid preparation of giant unil-amellar vesicles.Proc Natl Acad Sci，USA，Vol.93，pp.11443-11447，October1996Chemistry. 

　　* 基金项目:江西省科技厅基金资助项目（编号:E020801）
   
　　作者单位:330006江西南昌江西医学院药学系药剂学教研室