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【摘要】 目的 探求病毒性心肌炎猝死的法医病理学特异性诊断指标。方法 从华中科技大学同济医学院法医学系法医病理学教研室1999～2004年尸检档案中挑选案例27例，分为3组：(1)病毒性心肌炎猝死组（实验组）；(2)非病毒性心肌炎心脏性猝死组（对照组1）；(3)其他疾病及暴力死亡组（对照组2）。运用常规免疫组织化学（SABC法）染色和图像分析技术，观察上述各组病例的心肌组织中穿孔素（Perforin）和结蛋白（Desmin）的表达情况并进行统计学分析。结果 (1)穿孔素染色：病毒性心肌炎组心肌间质可见多数穿孔素表达阳性的淋巴细胞和单核细胞，其他两组无穿孔素表达阳性细胞；(2)结蛋白染色：病毒性心肌炎组心肌细胞中结蛋白表达明显下降，非病毒性心肌炎心脏性猝死组心肌细胞中结蛋白表达也下降，但程度比VMC猝死组轻，其他疾病及暴力死亡组心肌细胞中结蛋白含量和分布无明显变化。结论 (1)心肌间质中穿孔素的表达情况可作为病毒性心肌炎猝死的重要性诊断指标；(2)心肌细胞中结蛋白的表达情况能反应心肌细胞的损害程度,可作为病毒性心肌炎猝死的辅助诊断指标。
【关键词】 病毒性心肌炎；猝死；穿孔素；结蛋白；免疫组化；图像分析
病毒性心肌炎（Virus myocarditis，VMC）是较常见的心血管系统疾病之一。其临床症状悬殊，轻者可无明显自觉症状，重者可在发病1日内猝死。由于其症状、体征及实验室检查结果多缺乏特异性［1］，易导致临床误诊误治，不仅错失救治时机，而且常引发医疗纠纷，影响正常医疗工作秩序。法医检案中病毒性心肌炎所致猝死也比较常见，据统计其发生率在心血管系统疾病所致猝死中仅次于冠心病，案型多为医疗纠纷和疑为暴力致死者。目前法医病理学界对病毒性心肌炎猝死的诊断标准不一，缺乏客观且特异性诊断指标，过去的实际检案中多依赖排除法做推断性死因结论［2,3］。因此，寻求某些客观和特异性强的法医病理学诊断指标是临床和法医检案工作中亟待解决的课题之一。
1 材料与方法
1.1 材料和分组 从华中科技大学同济医学院法医学系法医病理学教研室1999～2004年尸检档案中挑选资料完整、死因诊断明确的案例27例。分为三组：(1)病毒性心肌炎猝死组（VMC组）7例；(2)非病毒性心肌炎心脏性猝死组10例；(3)其他疾病及暴力死亡组10例。
1.2 取材及制片 所有案例均在左心室、室间隔和左乳头肌等处取材，10％福尔马林液固定，常规石蜡切片，每块心肌组织切四份，三份分别供HE染色、Perforin和Desmin免疫组织化学染色，另一份留作备用。
1.3 免疫组化染色 常规SABC法，Perforin 1为兔抗人多克隆抗体，购自武汉博士德公司；Desmin 为小鼠抗人单克隆抗体，购自武汉博士德公司；试剂盒为武汉博士德公司提供的过氧化物酶标记的即用型SABC试剂盒。
1.4 图像分析和统计学分析 在10×40高倍显微镜视野中，从每张Perforin、Desmin免疫组化染色切片中随机选取5个视野，用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统-E49，测量每个视野中阳性细胞个数/扫描面积，然后取其平均值。对实验数据进行统计学检验，统计方法为方差分析和Tukey HSD检验。
2 结果
2.1 一般资料
2.1.1 病毒性心肌炎猝死组 7例中，男2例，女5例，男女性别比例为1：2.5。年龄构成为10～52岁，其中10～18岁之间3例，19～30岁之间成年人3例，50岁以上成年人1例，平均年龄为23.3岁。
2.1.2 非病毒性心肌炎心脏性猝死组 本组10例中，男7例，女3例，男女性别比例为2.3：1。年龄构成为23～58岁，平均为43.8岁。死因为冠心病猝死7例，心肌病2例，青壮年猝死综合征1例。
2.1.3 其他暴力或疾病死亡组 本组10例中男女各5例，比例为1：1。年龄构成为19～65岁，平均为36.4岁。死因为病理性颅内出血4例，颅脑损伤2例，中毒2例，细菌性痢疾1例，胃癌溃疡大出血致失血性休克1例。
2.2 Perforin免疫组织化学染色结果
2.2.1 显微镜下观察结果 Perforin免疫组织化学染色见心肌细胞核染成淡蓝色，胞浆染成浅棕黄色。VMC猝死组心肌间质可见多少不等的阳性表达细胞，表现为浸润的单核、淋巴细胞胞核为淡蓝色，胞浆周边染成深棕黄色。两个对照组病例均未发现Perforin表达阳性细胞（图1、2、3）。
2.2.2 图像分析和统计学分析结果 运用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统-E49测量每个视野中阳性细胞个数，每张切片随机取3个高倍视野，计数阳性细胞个数，然后取平均值。运用方差分析和Tukey HSD检验方法对各组实验数据进行统计学分析，结果表明，实验组和两个对照组之间阳性细胞表达的差异具有显著的统计学意义（P＜0.01）。两个对照组间比较差异无显著性(P＞0.05)（表1、表2）。
表1 三组病例心肌 perforin表达阳性细胞的比较（略）
表2 三组病例心肌perforin阳性细胞两两比较（略）
2.3 Desmin免疫组织化学染色结果
2.3.1 显微镜下观察结果 Desmine染色可见心肌细胞胞浆呈浅棕黄色，胞核呈淡蓝色。阳性反应物质呈深棕黄色。VMC猝死组和对照组1中心肌闰盘和横纹不清楚，阳性物质表达少、着色淡，甚至缺如，部分心肌细胞质内可见散在的阳性物质；对照组2中可见心肌闰盘及横纹处有密集浓染的棕黄色颗粒（图4、5、6）。
2.3.2 图像分析和统计学分析结果 运用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统-E49，测量每张切片中阳性细胞个数，每张切片随机取3个高倍视野，计数Desmin在心肌细胞内染色表达面积，然后取平均值。运用方差分析和Tukey HSD检验方法对各组实验数据进行统计学分析，结果表明，实验组和两个对照组之间结蛋白的表达差异有显著性(P＜0.01)。两个对照组之间结蛋白表达差异也有显著性（表3、4）。
表3 三组病例心肌desmin染色面积的比较（略）
表4 三组病例desmin染色面积两两比较（略）
3 讨论
3.1 病毒性心肌炎猝死心肌组织中perforin表达情况及意义 在病毒性心肌炎发病机制中，细胞介导的细胞毒作用机制是公认的心肌损伤机制，其介导细胞主要为CTL和NK细胞。主要效应分子为穿孔素和颗粒酶［4，5］。穿孔素 (perforin) 又名孔形成蛋白（pore forming protein, PFP）。1988年Podack等［6］报道了人类穿孔素的结构和表达。人穿孔素定位于10号染色体10q22，含两个内含子和两个外显子，基因全长6218bp，分子量约为66～75kD。它主要表达于活化的细胞毒性T细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）［7］，也有报道［8］在巨噬细胞、星形胶质细胞和脊髓的前体细胞中可见其表达，其结构和功能类似于补体C9。在CTL和NK细胞，PFP主要储存于胞浆颗粒中，是CTL和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。穿孔素损伤心肌细胞的主要机制有：穿孔素跨膜孔道可增加心肌细胞的渗透性，导致心肌细胞渗透性溶解；联合颗粒酶介导心肌细胞凋亡［9，10］；具体机制为：CTL细胞在MHC Ⅰ类抗原制约下识别靶细胞，通过抗原受体与抗原紧密结合，并从胞浆颗粒中释放出穿孔素。在Ca2+存在的条件下，穿孔素单体可迅速附着于靶细胞膜，嵌入靶细胞膜的双层磷脂中，多个单体聚合成形成打孔聚合物，在靶细胞膜上形成不同孔径（50～160nm）的跨膜通道，从而导致靶细胞膜去极化，使细胞外水分进入细胞内，细胞内电解质和大分子物质流出胞外，同时释放的颗粒酶也可以经此孔道进入靶细胞内，最终导致靶细胞渗透性溶解或凋亡［11］。对靶细胞进行攻击后的CTL细胞与裂解的靶细胞分离后又可攻击其他靶细胞，一个CTL细胞几小时内可杀伤几十个靶细胞。杨英珍等［12］研究发现，CVB3心肌炎小鼠心肌浸润细胞不但可以表达穿孔素，而且其表达水平与心肌病变程度呈正相关。另外穿孔素跨膜孔道对心肌细胞膜的损害，可导致其电生理特性异常，如动作电位时限缩短、静息电位和动作电位幅度下降、膜电位升高等。即穿孔素可导致心肌细胞结构的破坏和心肌组织功能障碍。
本实验也证实，在病毒性心肌炎猝死的7个病例中，心肌组织浸润的炎性细胞均可见穿孔素的表达，从显微镜下看，穿孔素表达强度与心肌细胞损害程度有一定关系。穿孔素表达明显处心肌组织损伤也较重，反而较轻；而另两个对照组病例中均未检见穿孔素表达阳性细胞，统计分析结果证实其差异具有显著性意义。说明细胞介导的细胞毒作用（CMC）的确为病毒性心肌炎主要发病机制之一，也说明穿孔素染色法可看作为病毒性心肌炎猝死法医病理学上较特异的诊断指标之一。
3.2 病毒性心肌炎猝死心肌组织中desmin表达情况及意义 近年来病理学界和法医病理学界对结蛋白颇为关注，主要围绕着结蛋白与心肌缺血及早期心肌梗死的关系进行了大量研究。结果［13，14］表明，心肌细胞结蛋白的变化对急性心肌缺血和心肌梗死的法医学鉴定具有重要意义。结蛋白为肌组织细胞骨架中间丝蛋白，在肌节Z线处浓集，形成横纹，并与其他收缩装置、线粒体和细胞核等相联系，在核孔处与核骨架Lamine B处相锚着。其功能为提供张力支持、细胞内机械力的综合、保持细胞形态、提供生化反应的支架和物质运输，还可能与基因表达的调节和信息传导有关［15］。结蛋白缺乏的小鼠心肌发生进行性变性/坏死并广泛钙化，表明其在维护心肌细胞的结构和功能完整性上具有重要意义［16］。从本实验的心肌结蛋白免疫组织化学染色结果看，对照组2显示结蛋白在心肌闰盘和横纹处浓集分布，而在VMC猝死组和对照组1的心肌中见结蛋白有不同程度的减弱甚至缺如，统计分析结果表明此差异具有显著性意义。说明此时中间丝蛋白的合成或者组装发生障碍，肌节的正常结构遭到破坏，这也可能是导致心肌的信息传导及收缩功能障碍以致心律失常、发生猝死的一个原因。结蛋白在VMC猝死组和对照组1中的表达均有明显减少，说明心脏性猝死者心肌细胞都存在实质性结构改变，只是程度不同而已，这与有的文献［14］报道有一定差异。病毒性心肌炎由于病毒的直接作用和细胞介导的细胞毒作用导致心肌细胞受到的损害比其他心脏性猝死者心肌细胞更明显，也进一步印证了病毒性心肌炎的病理学一般诊断标准。但由于非病毒性心肌炎心脏性猝死者的结蛋白表达跟正常心肌细胞中表达差异也具有显著统计学意义，实际检案中难以定量区分，故心肌组织中结蛋白的表达情况只能作为病毒性心肌炎猝死的辅助诊断指标之一，说明心肌细胞的损害程度。
4 结论
心肌间质中穿孔素的表达情况可作为病毒性心肌炎猝死的重要性诊断指标；心肌细胞中结蛋白的表达情况能反映心肌细胞的损害程度,可作为病毒性心肌炎猝死的辅助诊断指标。(本文图片见封三)
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16 Lockard VG, Bloom S. Trans-cellular desmin-lamin B intermediate filament network in cardiac myocyte. J Mol Cardiol,1993,25:303-309.
作者单位：1 430074 湖北武汉，中南财经政法大学公安学院
2 湖北武汉，华中科技大学同济医学院法医学系
(编辑：文 静)