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【摘要】 目的 为了评价华支睾吸虫分泌-排泄抗原在早期和轻度感染时诊断中的价值，对华支睾吸虫的成虫粗抗原和分泌-排泄抗原的抗体滴度进行了比较。方法 实验动物分两个组，各组感染10个囊蚴和100个囊蚴，分别感染1天，3天，1周，2周，3周和4周测抗体滴度，评价了分泌-排泄抗原在早期和轻度感染时诊断中的意义。结果 检测结果显示粗抗原抗体滴度平均值为0.162，明显低于分泌排泄抗原的抗体滴度平均值0.188，并统计学上有差异(P<0.05)。轻度和重度感染时分泌-排泄抗原分别为第2周和第3周开始出现阳性反应，而粗抗原分别为第3周和第4周才开始出现阳性反应。结论 华支睾吸虫的分泌排泄抗原是华支睾吸虫早期诊断和轻度感染时的有效抗原。
【关键词】 华支睾吸虫; 分泌-排泄抗原;酶联免疫吸附实验; 早期诊断; 轻度感染
华支睾吸虫寄生于人和哺乳动物的肝胆管内，是一种重要的人兽共患寄生虫病。感染华支睾吸虫可引起慢性胆囊炎、胆石病、胆内结石、胆管肝炎、肝胆管上皮细胞癌等症状。它分布于中国、日本、朝鲜、前苏联和越南等国家和地区。国内已报道25个省市均有分布［1］。华支睾吸虫的诊断虽然做大便检查可以确诊，但是因虫卵小，容易漏诊，并与其他寄生虫的虫卵要鉴别。因此，应用免疫学诊断方法检测华支睾吸虫抗体是重要的辅助诊断仪据。已经用于华支睾吸虫的检查方法有皮内试验，补体结合试验，血清凝集试验，对流免疫电泳及酶联免疫吸附(ELISA)，其中ELISA方法是敏感性和特异性较高的一种常用的检测手段［2］。目前，最常用的ELISA 诊断抗原是粗抗原，它具有较高的敏感性和特异性，但其他吸虫有交叉反应。最近，国外已有报道华支睾吸虫的分泌排泄抗原比粗抗原具有更高的敏感性和特异性［3］。在本实验中，我们利用了华支睾吸虫的分泌排泄抗原和粗抗原，检测感染华支睾吸虫的大白鼠的抗体，评价了分泌-排泄抗原在早期及轻度感染时诊断中的意义。
1 材料与方法
1.1 华支睾吸虫囊蚴的分离 用人工消化法消化麦穗鱼，在解剖显微镜下分离囊蚴。
1.2 抗原的制备 用囊蚴感染新西兰兔(延边大学医学院动物室)，3个月后处死动物，取出肝脏，分离虫体。华支睾吸虫虫体用匀浆机磨碎2min，在12000转/min离心1h，上清液为粗抗原。采集新鲜虫体用PBS冲洗3次，置0.01M pH 7.2 PBS 培养液中（内含抗生素）37℃培养15h，收集上清液，4℃ 3000rpm 离心10min，分离虫卵，并用12000rpm离心30min去除精子，取上清液为分泌－排泄抗原，紫外分光光度计测定蛋白浓度，分装，-20℃保存备用。
1.3 实验动物 SD大白鼠来自延边大学医学院动物室，体重200～250g，雄性，共40只，分两个组。其中，一组感染华支睾吸虫囊蚴10个，另一组感染100个。实验动物用囊蚴感染，感染1日、3日、1周、2周、3周及4周抽血。
1.4 血清分离 大白鼠用颈椎脱臼法处死后，从心脏抽出3～5ml血，在室温放置1h，用3000转/min离心10min，分离血清，置-20℃保存待用。
1.5 酶联免疫吸附(ELISA)实验 酶联免疫吸附实验用一般的方法进行，包被抗原板1h，洗板5次，封闭液为脱脂奶粉，第一抗体用大白鼠血清，酶结合物选择抗大白鼠IgG酶标记抗体，发色液为TMB(tetramethylbenzidine)，用酶标仪(MK3型号，芬兰)在450nm处测吸光度。OD值0.25为阳性。
2 结果
将所得各种华支睾吸虫组织抗原用ELISA方法检测大白鼠血清抗体滴度，检测结果显示粗抗原抗体滴度平均值为0.162明显低于分泌排泄抗原的抗体滴度平均值0.188，并统计学上有差异(P<0.05)（表1）。大白鼠感染10个囊蚴时第四周开始出现阳性反应，而大白鼠感染100个囊蚴时则第3周开始出现阳性反应。轻度感染组，分泌排泄抗原第3周开始出现抗体阳性，而粗抗原第4周才出现阳性反应。重度感染时，分泌排泄抗原和囊蚴抗原第2周开始出现抗体阳性，而粗抗原第3周才出现阳性反应(图1)。
表1 不同程度感染华支睾吸虫不同时期大白鼠的抗体滴度变化（略）
注：表示抗体滴度>0.25，华支睾吸虫血清抗体阳性
图1 轻度和重度感染时大白鼠的抗体滴度变化（略）
三角形表示粗抗原的抗体滴度，而方形则表示分泌排泄抗原的抗体滴度;实心表示轻度感染，而空心则表示重度感染
3 讨论
自从上世纪80年代以来，ELISA已被广泛的应用于多个学科，经过不断的改进和完善，该法已成为十分成熟的免疫学诊断方法，也是最广泛地用于华支睾吸虫的免疫学诊断。ELISA所用抗原多为成虫可溶性蛋白抗原，根据众多学者的研究和应用，其敏感性可达83.1%～100%，但与日本血吸虫、肺吸虫有10%左右的交叉反应(Rim 1990)。为了提高ELISA 测定的特异性，分泌排泄抗原已用于华支睾吸虫的诊断(Kim，1998)。最近，有报道华支睾吸虫的分泌排泄抗原的敏感性(92.5%)和特异性(93.1%)高于成虫粗抗原(各88.2%，87.8%)［4］。在本实验中，我们利用了成虫粗抗原和分泌排泄抗原，用ELISA 方法检测不同程度感染华支睾吸虫的大白鼠的不同时期的抗体，评价了诊断中的意义。本实验结果表明，大白鼠的感染程度与血清内IgG水平成比例，并分泌-排泄抗原的抗体滴度明显高于粗抗原，分泌排泄抗原可用于华支睾吸虫病的早期和轻度感染时的诊断。目前，有关分泌排泄抗原的抗原性研究已达到分子生物学水平，从分泌排泄抗原分离的7kDa，17kDa和28kDa已被证明为抗原性蛋白质条带，并已表达为重组蛋白质，用于华支睾吸虫的诊断［5］。但是获得充分的分泌-排泄抗原实际上有一定的难度，在今后的研究中，确定分泌-排泄抗原的有效成分，研制重组蛋白将弥补这些不足。
【参考文献】
1 刘宣升，陈明.华支睾吸虫的生物学和华支睾吸虫病防治. 北京：科学出版社，1998，85-126.
2 Chen CY，Hsieh WC，Shih HH，et al. Immunodiagnosis of clonorchiasis by enzyme-linked immunosorbent assay. Southeast Asian J Trop Med Public Health，1988，19: 117-121.
3 Kim SI. A Clonorchis sinensis-specific antigen that detects active haman clonorchiasis.Korean J Parasitol，2002，36: 37-45.
4 Choi MH，Park IC，Li S，et al. Excretory-secretory antigen is better than crude antigen for the serodiagnosis of clonorchiasis by ELISA. Korean J Parasitol，2003，41: 35-39.
5 Zhao QP，Moon SU，Lee HW，et al. Evaluation of Clonorchis sinensis recombinant 7-kilodalton antigen for serodiagnosis of clonorchiasis. Clin Diagn Lab Immunol，2004，11(4):814-817.
(编辑：守 中)
作者单位：133000 吉林延吉，延边大学体育学院理论学教研室
133000 吉林延吉，延边大学医学院免疫学与病原生物学教研室(Δ通讯作者)