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【摘要】 目的 为了评价华支睾吸虫分泌-排泄抗原在华支睾吸虫病血清学诊断中的价值，应用ELISA技术对华支睾吸虫的成虫粗抗原和分泌-排泄抗原的敏感性和特异性进行了比较。方法 制备了华支睾吸虫的粗抗原和分泌-排泄抗原，以ELISA 方法对华支睾吸虫感染患者509例、麝猫后睾吸虫感染者47例、卫氏并殖吸虫感染者20例、日本血吸虫感染者14例以及健康人血清163例，检测血清特异性IgG，比较华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原的敏感性和特异性。结果 分泌-排泄抗原的诊断的敏感性（92.5%）高于粗抗原（88.2%）（P＜0.05)，并分泌-排泄抗原的特异性反应（93.1%）明显高于粗抗原（87.8%）（P＜0.01)。 结论 分泌-排泄抗原用于感染华支睾吸虫病有较高的敏感性和特异性，是一种有效的诊断抗原。
【关键词】 华支睾吸虫；分泌-排泄抗原；酶联免疫吸附(ELISA)实验；诊断
华支睾吸虫又称肝吸虫，是一种严重危害人体健康的人兽共患寄生虫病。主要分布于东亚和华人社区，估计有2500万感染，其中国内有1000万感染者［1］。华支睾吸虫病的诊断虽然做大便检查可以确诊，但是因虫卵小，容易漏诊，并与其他寄生虫的虫卵要鉴别。因此，应用免疫学诊断方法检测肝吸虫抗体是重要的辅助诊断仪据。 已经用于华支睾吸虫的检查方法有皮内试验，补体结合试验，血清凝集试验，对流免疫电泳及酶联免疫吸附(ELISA)，其中ELISA 方法是敏感性和特异性较高的一种常用的检测手段。目前，最常用的ELISA 诊断抗原是粗抗原，它具有较高的敏感性和特异性，但其他吸虫有交叉反应。 最近，国外已有报告华支睾吸虫的分泌-排泄抗原比粗抗原具有更高的敏感性和特异性［3］。 在本实验中，我们利用了华支睾吸虫的粗抗原和分泌排泄抗原检测患者血清抗体，评价了分泌-排泄抗原在诊断中的有用性。
1 材料与方法
1.1 华支睾吸虫粗抗原及分泌-排泄抗原的制备
1.1.1 粗抗原 华支睾吸虫第二中间宿主麦穗鱼采自沈阳郊区，用人工消化法消化麦穗鱼，并收集囊蚴。新西兰兔(延边大学医学院动物室)感染新鲜囊蚴，3个月后处死并取出肝脏，在解剖显微镜下分离虫体。用PBS（磷酸盐缓冲液，0.2M，pH 7.2～7.4）冲洗新鲜虫体后，加入等体积的PBS，用漩涡混合器打匀5min，12000rpm离心30min，收集上清即为粗抗原。
1.1.2 分泌-排泄抗原及虫卵抗原 采集新鲜虫体用PBS冲洗3次，置0.01M pH 7.2 PBS培养液中（内含抗生素）37℃培养15h，收集上清液，4℃ 3000rpm，离心10min，分离虫卵，并用12000rpm，离心30min去除精子，取上清液为分泌－排泄抗原，紫外分光光度计测定蛋白浓度，分装，-20℃保存备用。
1.2 待检血清 华支睾吸虫感染血清509份取自黑龙江省肇源县。这些感染者均有长期食用生鱼的历史，并粪检阳性。163例健康者血清取自非流行区无病症且粪检阴性者作为阴性对照。另外，其他相关吸虫患者血清作交叉反应实验: 麝猫后睾吸虫患者47例，日本血吸虫患者14例，卫氏并殖吸虫患者20例。 所有吸虫患者均经寄生虫病原学检测确诊。
1.3 酶联免疫吸附(ELISA) 酶联免疫吸附实验用一般的方法进行，将华支睾吸虫不同组织抗原用0.1mol/L NaHCO3缓冲液（pH9.6）稀释成10μg/ml，每孔100μl包被96孔聚丙乙烯酶标板，4℃过夜。用含3%脱脂奶粉的PBS-Tween20(PBST)(pH 7.2，0.05%) 封闭37℃60min。用PBST洗涤5次，加待检血清（华支睾吸虫，囊虫血清1:25或卫氏并殖吸虫，裂头蚴血清1:100稀释）100μl，在37℃培养箱孵育60min。用PBST洗涤5次，加（1:50000稀释）辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人的IgG（US Biochemical Cooperation）100μl，在37℃培养箱孵育60min。PBST洗涤5次，加底物3，3′，4，4′-四甲基联苯胺（TMB）和0.1%H2O2，10min。用酶标仪(MK3型号，芬兰)在450nm处测吸光度。OD值小于0.25为阴性，大于或等于0.25为阳性。
1.4 统计学分析 所有统计分析均用SPSS 10.0统计软件进行，数据用平均数±标准偏差表示，并进行方差分析。
2 结果
表1显示对照组和检测各组吸光度的平均值。用粗抗原检测抗体的ELISA法检测各组血清，阴性对照组的平均吸光度值较低，为0.066±0.058，且个体间差异较小，华支睾吸虫患者血清的平均吸光度值为0.353±0.115，麝猫后睾吸虫患者血清为0.261±0.135，日本血吸虫患者血清为0.093±0.124，卫氏并殖吸虫患者与肝片形吸虫患者血清的平均吸光值稍高于0.1。而用分泌-排泄抗原检测抗体时，对照组血清样本的吸光值和粗抗原检测的吸光值在相似的水平上，华支睾吸虫患者血清的平均吸光度值升高到0.404±0.129，而其他吸虫患者血清的吸收值均有所下降。 509例华支睾吸虫患者血清，449例在粗抗原检测抗体中为阳性，敏感性为88.2%；471例在分泌-排泄抗原检测时为阳性，敏感性为92.5%，统计学上差异有显著性（P＜0.05），见表2。在粗抗原和分泌-排泄抗原的ELISA检测中，对照组血清和肝片吸虫患者血清均末见交叉反应，但麝猫后睾吸虫患者血清在两种抗原检测中均有较高的交叉反应，日本血吸虫患者及卫氏并殖吸虫患者用粗抗原作检测交叉反应，分别为7.1%（1/14）与25%（5/20），而用分泌-排泄抗原作检测，均末见交叉反应。分泌-排泄抗原检测抗体的ELISA法特异性显著高于用粗抗原检测抗体的ELISA法（特异性分别为93.1%和87.8%）。见表3。
表1 华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原吸光度的比较（略）
注：*P<0.05，**P<0.01
表2 华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原敏感性的比较（略）
注：*P<0.05
表3 华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原特异性的比较（略）
注：*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
自从上世纪80年代以来，ELISA已被广泛的应用于多个学科，经过不断的改进和完善，已成为十分成熟的免疫学诊断方法，也是最广泛地用于华支睾吸虫的免疫学诊断。ELISA所用抗原多为成虫可溶性蛋白抗原，根据众多学者的研究和应用，其敏感性可达83.1%～100%，但与日本血吸虫，肺吸虫有10%左右的交叉反应［3］。为了提高ELISA 测定的特异性，不同抗原已用于华支睾吸虫的诊断。有关华支睾吸虫特异性抗原包括全虫抗原、表皮膜抗原、代谢抗原、虫卵抗原及去膜虫体抗原等，其中已证明代谢抗原的血清敏感性较高，其抗原中可能含有高活性的组分［4］。本文证实，用华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原作诊断抗原，以ELISA法诊断人体华支睾吸虫病及其他寄生虫病，其诊断的敏感性和特异性均分泌-排泄抗原优于粗抗原。
华支睾吸虫的分泌-代谢抗原的抗原条带为7～8，12.5，17及26～28kDa，而粗抗原还可以观察到35，43，70kDa，其中7和8kDa是主要成分［5］，并分泌-排泄抗原已被证实为急性感染期的有效诊断抗原［6］。华支睾吸虫7～8kDa可能是7和8kDa的混合物，在免疫组织化学染色中，它们集中分布于体表及精子囊，并已证明这些条带提高诊断的功效。分泌-排泄抗原的另一个成分是12.5和17kDa，其中17kDa蛋白质条带已被证明为半胱氨酸蛋白酶［3］。这条带蛋白质抗原性并不强，但与其他吸虫有较普遍的交叉反应，因此从分泌-排泄抗原中能排除此成分将提高诊断的特异性。12.5kDa条带，目前为止还没有正式报道过。分泌-排泄抗原的第三种成分是26和28kDa条带。这两种条带是一种蛋白质类型，已证实为谷胱甘肽S转移酶。这两种条带具有抗原性，与其他寄生虫有较低的交叉反应，已被看待候补诊断抗原［7］。
华支睾吸虫的分泌-排泄抗原用于ELISA检测中，可提高诊断的敏感性和特异性。分泌-排泄抗原的敏感性的提高可能与7～8和26～28kDa条带的高含量有关。粗抗原除了这两种抗原条带以外，还含有其他蛋白质条带，因此这些有效抗原成分很可能被稀释，导致敏感性的降低。已有报道华支睾吸虫粗抗原中35和70kDa抗原蛋白与其他蠕虫有交叉反应［8］。分泌-排泄抗原含有较高的7～8和26～28kDa 抗原条带，但含有少量的35或70kDa蛋白质条带，因此可以提高诊断的特异性。
ELISA检测特异性抗体已广泛应用于寄生虫病检查，包括华支睾吸虫病。而分泌-排泄抗原的应用将提高诊断的敏感性和特异性，但是获得充分的分泌-排泄抗原实际上有一定的难度。在今后的研究中，确定分泌-排泄抗原的有效成分，研制重组蛋白将会弥补这些不足。
【参考文献】
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(编辑：守 中)
作者单位：133000 吉林延吉，延边大学医学院病理生理教研室(免疫学与病原微生物教研室)
133000 吉林延吉，延边大学医院医务科(Δ通讯作者)