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【摘要】 随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌出现耐药，其耐药水平也越来越高。细菌耐药给病人和医生造成许多难题，导致疗程延长和死亡率的升高。近年来许多科学家和临床医生都在寻找有效的消除耐药质粒的方法，试图恢复细菌对药物的敏感性，并取得了一定的进展。本文对近年药物消除细菌耐药性质粒(R质粒)的研究进行了综述。
【关键词】 消除；耐药性质粒
自20世纪40年代弗莱明发现青霉素以来，人类便进入了抗生素时代，抗感染治疗也由此进入了新纪元。感染性疾病的病死率大大降低，半个多世纪以来，人类一直把抗菌药物作为抗感染治疗最有力的武器，抗菌药物的研究也得到了迅速的发展，然而随着抗菌药物的广泛应用，感染性疾病的治疗又遇到了新的挑战，即细菌对抗生素产生了耐药性，这又给人类带来了新的灾难。1959～1990年在日本由Akiba和Ochiai等人发现并证实多重耐药性可在大肠杆菌和志贺菌间互相传递，1962年将此种传递耐药性的因子命名为耐药性因子或R因子-即目前的耐药性质粒(R质粒)，它是细菌内染色体外具有独立复制能力的对细菌生存非必需的小型共价闭合环状双链DNA分子，其上携带着的耐药基因赋予了细菌对某些抗生素的耐药，广泛存在于革兰阳性和阴性菌中，几乎所有致病菌皆有之。耐药质粒可自宿主细胞内自发消除，但很缓慢，其消除频率为10-2～10-8。细菌耐药性的出现和耐药细菌的感染给临床抗感染治疗带来极大的挑战，但随着基因组研究的进展，学者们发现破坏耐药基因即可使细菌恢复对抗菌药物的敏感性。因此，近30年来，国内外的一些研究者积极寻找一种有效的方法去消除耐药质粒，以逆转细菌耐药，并取得了一定的进展。现就国内外学者用药物消除质粒的研究综述如下。
1 化学试剂对质粒的消除作用
1.1 十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS) 细菌染色体DNA与质粒DNA的一个共同特点是它们均附着于细胞膜上进行复制。SDS是一种离子型表面活性剂，在合适的浓度下它能溶解膜蛋白，破坏细胞膜，SDS可改变质粒在细胞膜上的结合位点，使其不能精确复制，并最终导致质粒不能正确地分配到子细胞中，从而达到消除质粒的目的。SDS另一个可能的作用机理是：当它进入细胞质后，使某些与质粒复制及分配有关的蛋白部分或完全失活，造成质粒的丢失。其消除效果与其浓度和作用温度密切相关：浓度太高，会抑制细菌生长，浓度太低，质粒消除不理想；同样，适宜的温度也可以取得理想的质粒消除效果。Sonstein SA［1］等报告用0.002% SDS对金黄色葡萄球菌青霉素B质粒有0.57%～1.34%的消除作用，用0.6% SDS，消除率则为100%。周红［2］等用10%的SDS消除耐阿洛西林绿脓杆菌质粒，消除率为77.5%，刘渠［3］等人将SDS法与高温法相结合，经37℃、43℃两种温度及SDS的有无进行交替传代，探索出变温-SDS消除法，同时达到了细菌的较好生长和较佳的质粒消除效果。质粒消除率达到86%～100%。李林［4］等人使用逐级从42℃到44℃和46℃升温培养、并用0.05% SDS处理细菌的方法，同样取得了理想的质粒消除效果。
1.2 嵌合染料 嵌合染料包括吖啶黄(Acriflavine)、吖啶橙(Acridine orange，AO)、溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)等可用作质粒消除剂(Curing agent)，其作用机理是选择性地抑制质粒的复制。吖啶橙是嵌入DNA双链中影响质粒复制的色素，据报道［5］其消除率为50%。Nakamura H等还发现吖啶橙加入磷酸盐时其质粒消除效果得到了显著提高。磷酸盐有可能影响细胞膜的结构，使膜的通透性增强所致。Singh M等用AO消除E1coli K12 J53中的质粒发现当E1coli K12 J53处于指数生长期时，AO作用效果最佳，细胞处于其他生长阶段或AO过量，质粒消除率极低或根本无效。溴化乙锭是一种诱变剂，一般不采用，但其消除效率比SDS高。Bouanchaud等用EB以较高的频率消除了肠细菌和葡萄球菌中带有抗生素抗性的质粒，实验结果的可重复性也优于吖啶类物质。Mattarelli P［6］等报道溴化乙锭对双歧杆菌的质粒消除率为100%，而用吖啶橙处理，质粒消除率为58%。国内杨春梅［7］等人研究发现其对痢疾杆菌的耐药质粒有较好的消除作用，以连续培育法，48h消除率可达20%，120h消除率可达85%；用高浓度SDS培养，消除率为27%。
1.3 其他化学试剂 Tewari S等在用消毒剂对从污染的饮用水中分离的大肠杆菌作用的研究中发现亚致死剂量的消毒剂可以完全消除对耐链霉素的质粒。结晶紫、苯甲酸酯、麻醉剂等都有质粒消除作用，它们可能通过影响细菌细胞膜的通透性或影响DNA复制所必需的酶的合成、代谢发挥作用。
2 化学药物对质粒的消除作用
2.1 抗生素类 抗生素在高浓度时起抗菌作用，但在亚抑菌浓度时却有质粒消除作用。
2.1.1 氟喹诺酮类 目前，研究较多的是氟喹诺酮类药物的质粒消除作用。氟喹诺酮类药物能抑制DNA旋转酶A亚单位的活性，影响DNA的复制，从而达到快速抗菌和消除质粒的作用。同时发现这种亚抑菌消除浓度不会诱导选择出耐药突变株，甚至还可能加强受试菌对其他化疗剂的敏感。Courtright JB等人研究发现喹诺酮类能有效的治疗带有R质粒的耐药菌株。Fu KP［8］等人研究也表明喹诺酮类对R质粒有一定的消除作用，并且发现不同的药物不同耐药质粒的消除率不一样：对pORF2的消除，氟啶酸为43%，培氟沙星和阿环丙沙星为12%，氨氟沙星为9%，氧氟沙星为7%，多氟哌酸为4%；喹诺酮类对质粒pSC194、pBR322和pMH612消除率很低，对R1、pP1603和pUB110几乎没有影响。国内谢一俊［9］等人的研究表明，氟哌酸对18株多重耐药鼠伤寒菌的耐药质粒的消除率达72.2%(13/18)，不同菌株、不同耐药型的耐药性质粒消除情况明显不同。黄瑞等人用氧氟沙星对PrST98的伤寒杆菌、大肠杆菌和鼠伤寒杆菌进行亚抑制浓度的质粒消除试验，结果表明氧氟沙星能降低PrST98宿主菌的耐药性。
2.1.2 头孢类 头孢类药物为广谱抗生素，在发生杀菌作用的同时，也可部分地消除其他细菌的耐药质粒。高枫等人在用头孢类药物对急性痢疾病人治疗时，发现患者用头孢类药物2周后体内大肠杆菌对不同的抗生素耐药率均有不同程度的降低；同时耐药性质粒的区带亦有显著减少。
2.1.3 其他抗生素 香豆霉素及新生霉素是DNA解旋酶的抑制剂。DNA解旋酶能使完成了复制的两个子代环状双链DNA互相分开，当它被抑制时，质粒DNA复制中间物大量积累，不能产生子代DNA。Danilevskaya O N［10］等研究发现低浓度的香豆霉素就可有效地消除E1coli K12中的质粒pBR322、pMB9，此外用浓度为1～7μg/ml的香豆霉素还可消除E1coli K12C600中的ColE1质粒，当香豆霉素浓度为5μg/ml时，效果最佳并且细胞存活率最高。Aooper，-D-C［11］等还发现同样作用于DNA旋转酶的药物，其质粒消除作用却显著不同。作用于旋转酶B亚单位的新生霉素、香豆霉素等对大肠杆菌的质粒消除率超过99%，比作用于旋转酶A亚单位的萘啶酸的作用高很多。利福平能直接与细胞中的RNA聚合酶结合并抑制其活性。Johnston等研究了用利福平消除金黄色葡萄球菌中的质粒ComI，ComI编码青霉素抗性、镉离子抗性及红霉素抗性基因。当初始细胞量为105/ml，利福平浓度为0.01μg/ml时，质粒消除效果最佳，对青霉素敏感的菌落同时也失去了对镉离子及红霉素的抗性，表明整个ComI质粒已被消除。George BA［12］等发现斑贝霉素根据质粒的类型，可以减少或增加R质粒的传递频率，同时也可以选择性的抑制细菌中某些R质粒的生长。Bineva I等研究表明杆菌肽锌也可以有效的消除E.coli中的耐药质粒，并且发现药物浓度越高，质粒的消除率也越高。
研究中还发现抗生素同某些化合物联用时，其抗菌作用和质粒消除作用可得到提高。Gunics等就证实了BaDHP(3，5-二苯甲酰-1，4-二氢嘧啶)本身无质粒消除作用，却可提高红霉素和异丙嗪的质粒消除作用。
2.2 三环类精神药物 三环类精神药物可以消除溶血素转运蛋白的编码质粒，消除质粒后的大肠杆菌对四环素的MIC显著低于其质粒未消除的细菌。Molnar J［13～15］报道三环类精神药物具有抗质粒活性，其抗质粒机制可能为该药物增加细菌细胞的膜通透性(细菌细胞膜上的受体结合位点可能同神经细胞的受体结合位点相似)，抑制质粒DNA螺旋酶使之难以形成超螺旋，从而抑制质粒的复制。Evdokimova OV等研究报道亚抑菌浓度的非那根(100～450mg/ml)可以促进R质粒的消除。MiskoIic，-C等报道，这类具三环结构的药物同质粒发生共价结合，尤其同G-C富集区有更高的亲和力，使得质粒不能正常复制。
3 中草药对质粒的消除作用
近年来国内对用中草药消除质粒的研究较多。中药的种类大都以具有清热解毒或一定的抗菌功能为主，主要用于消除绿脓杆菌和大肠埃希氏菌的R质粒。但消除率有较大的波动，不同研究者对相同药物对同一细菌的研究结果也存在较大的差异。鞠洪涛［16］报道大蒜油对大肠埃希氏菌氨苄青霉素耐药性有消除作用；鱼腥草、紫草对大肠埃希氏菌庆大霉素耐药性及耐药质粒有消除作用，消除率分别为2.98%和4.20%。陈群［17～19］等则报道黄连黄芩消除率作用24h为2.42%，作用48h高达22.57%，并发现体内消除R质粒的最佳时间为48h。王云［20］等用马齿苋、金银花提取液对绿脓杆菌PA11株R质粒体内消除研究，结果显示，两种药作用24h均未获得消除子，作用48h和72h R质粒平均消除率马齿苋为2.15%、金银花为12.25%，消除子均表现为多重耐药性丢失。于军［21］等用射干提取液对铜绿假单胞菌PA11株R质粒体内外消除作用的研究中发现射干提取液对PA11株所携带的R质粒具有消除作用，体外R质粒消除率为1.8%，体内R质粒消除率为4.4%，对照组自然消除率为0。有的研究者还研究了一些中药复方制剂(如三黄片、治泻灵)的抗质粒作用，康梅［22］等人就用三黄片对大肠杆菌多重耐药株进行质粒消除试验，研究表明，三黄片对耐药质粒有较强的消除作用。林成水［23］等从蔷薇属和木瓜属中筛选出几种植物，提取配成消质灵Ⅰ号和Ⅱ号制剂，报道其对肠道细菌的质粒消除率为68.6%。陈群［24］等在用黄芩与止痢灵对大肠杆菌R质粒消除作用的研究中发现黄芩和止痢灵对大肠杆菌携带的R质粒具有消除作用，其消除率为2.42%和2.14%。单用黄芩或止痢灵，绝大多数消除了表现为单一耐药性的丢失；而黄芩和止痢灵联合应用，其消除率可提高至18.14%，且细菌不仅表现为单一耐药性的丢失，还表现对多重耐药性的丢失。雷连成［25］等人在用IT2(黄连提取物)对大肠杆菌耐药性质粒的研究中发现IT2对大肠杆菌的部分耐药性具有良好的抑制作用，且发现其作用与阻碍耐药质粒的拷贝、恢复外膜通道蛋白正常表达关系密切。
4 质粒消除剂的意义与评价
细菌耐药性形成一直是困扰科学家和临床医生的难题，而细菌中绝大多数耐药性都是由独立于菌体染色体以外的遗传物质-质粒所编码。如果能消除细菌中的耐药质粒，则可恢复耐药菌株对抗生素的敏感性，对于治疗临床上由耐药菌导致的感染和阻断耐药性的传播都有非常重要的意义。
国内外的研究者们做了大量的研究发现，无论是化学物质还是中草药，都具有一定的质粒消除作用。但无论哪种消除剂都不能消除所有的R质粒，各种质粒的消除率也相差甚远：比如喹诺酮类对pORF2的消除，氟啶酸为43%，培氟沙星和阿环丙沙星为12%，氨氟沙星为9%，氧氟沙星为7%，多氟哌酸为4%；而对质粒pSC194、pBR322和pMH612消除率很低，对质粒R1、pP1603和pVB110则几乎没有影响［8］。而且，已研究的一些消除剂普遍的存在着两方面的问题：一是很多消除剂对人体有害或方法本身不适用于人体，就如目前比较肯定的化学消除剂十二烷基硫酸钠(SDS)和溴化乙锭(EB)，它们在适当的作用浓度和温度下均可达到100%［3，6］，但是这些化学试剂在消除质粒的同时，对人体也会产生一定的危害；二是消除剂对耐药质粒的消除率较低，比如我国特有的、天然的中药黄连，虽然其毒副作用小，但是就目前的研究表明最高消除率仅能达到22.57%［17～19］。
迄今为止，还没有一个较好的可供体内使用的清除R质粒的方法，要将消除R质粒投入实际临床应用，还有很大的难度。相信随着研究的深入，研究方法的科学化和标准化，研究者们能够探求出安全、高效、经济的质粒消除剂。
【参考文献】
1 Sonstein SA.Nature of elimination of penicillinase plasmid from Staphloceoccus by surface-active agents.J bact，1972，111(1)：152-155.
2 周红，王浴王.用SDS消除耐阿洛西林绿脓杆菌质粒.中国抗生素杂志，1992，(3)：238-239.
3 刘渠，白松涛.G+球菌及G-杆菌质粒消除方法的研究.中国卫生检验杂志，1998，8(5)：275-278.
4 李林.苏云金芽抱杆菌无晶体突变株的逐级开通筛选及其转化性能.微生物学报，2002，40(1)：85-90.
5 盛祖嘉.微生物遗传学.北京：科学出版社，1981，296-311.
6 Mattarelli，-p，Biavati，-B.Characterization of the plasmid pVS809 from Bifidobacterium globosum.New-Microbiol，1994，17(4)：327-331.
7 杨春梅，马治平.BDH、EB、SDS对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用.西北药学杂志，2000，15(2)：64-65.
8 Fu KP.Elimination of antibiotic-resistant plasmids by quinolone antibiotics.Chemotherapy，1988，34(5)：415-418.
9 谢一俊.氟哌酸体外消除鼠伤寒沙门氏菌耐药质粒的研究.中国人兽共患病杂志，1998，14(5)：77-79.
10 Danilevskaya ON，Gragerov AI.Mol Gen Genet，1980，178：233-235.
11 Aooper，-D-C.Elimination of plasmid pMG110 from E coil by novobicin and other inhibitors of DNA gyrase.Antimicrob-Agents-Chemother，1984，25(5)：586-590.
12 George BA.Effect of bambermycins，in vitro，on plasmid-mediated antimicrobial resistance.Am J Vet Res，1984，45(11)：2336-2341.
13 Molnar J.Antiplasmid activity of tricyclic compounds.Methods Find Exp Clin Pharmacol，1988，10(7)：467-474.
14 Molnar J.Inhibition of bacterial plasmid replication by stertoselection binding by tricyclic psychopharmacons.Res-Commun-Chem-Pathol-Pharmacol，1984，43(2)：235-249.
15 Molnar J.Antiplasmid activity：loss of bacterial resistance to antibiotics.APMIS Suppl，1992，3(4)：6.
16 鞠洪涛.中草药消除大肠埃希氏菌耐药性及耐药质粒的研究.中国兽医科技，2000，30(3)：27-29.
17 陈群，王胜春.黄芩和黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研究.广东医学院学报，1998，16(1-2)：1-3.
18 陈群，陈南菊.黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研究.中国中西医结合杂志，1996，16(1)：37.
19 陈群，陈南菊.黄连对大肠埃希氏菌E102株R质粒消除作用研究.广东医学院学报，1998，16(1-2)：161.
20 王云，于军，关显智，等.马齿苋、金银花提取液对绿脓杆菌PA 11株R质粒体内消除作用的比较.中国微生态学杂志，2000，12(4)：197-198.
21 于军，于红，肖洋，等.射干提取液对铜绿假单胞菌PA 11株R质粒体内外消除作用.吉林大学学报(医学版)，2003，29(2)：170-171.
22 康梅，陈知行，许秀成，等.三黄片对大肠杆菌耐药质粒消除作用的研究.华西药学杂志，1999，14(5-6)：406-408.
23 林成水.消质灵消除产毒大肠杆菌质粒的研究.中国人兽共患病杂志，1992，8(6)：28-30.
24 陈群，王胜春.黄芩与止痢灵对大肠杆菌R质粒消除作用的研究.中国微生态学杂志，1998，10(2)：80-82.
25 雷连成，韩文瑜，段艳.大肠杆菌耐药性抑制剂的初步研究.中国兽药杂志，2004，38(2)：18-21.
(编辑：守 中)
作者单位：330006 江西南昌，江西医学院研究生部2003级科研(1)班
201203 上海，上海中医药大学病原生物教研室