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【摘要】 目的 观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对体外培养人胃癌细胞系（SGC-7901）细胞的增殖抑制作用和体内抗人胃癌作用。方法 MTT法检测EGCG对人胃癌（SGC-7901）细胞株的生长抑制作用；以人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型治疗实验，评价EGCG治疗人胃癌的有效性;通过TUNEL和免疫组化检测移植瘤细胞的凋亡情况。结果 在体外抗癌细胞增殖实验中EGCG对人胃癌SGC-7901细胞的IC50为58.60μg/ml。EGCG对人胃癌细胞株SGC-7901裸鼠移植瘤的抑瘤实验中5mg/(kg·d) EGCG作用20天的平均抑瘤率为34.51%，P＜0.05；10mg/(kg·d)EGCG作用20天的平均抑瘤率为45.81%，P＜0.01；20mg/(kg·d) EGCG作用20天的平均抑瘤率为54.64%，P＜0.01。瘤细胞凋亡增加，TUNEL阳性细胞计数均值EGCG 5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg组分别为2.59±2.81、4.3±2.58和5.96±2.13。结论 EGCG对人胃癌细胞株SGC-7901有不同程度的生长抑制作用，对人胃癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用可能与肿瘤细胞凋亡增加有关。
【关键词】 EGCG；裸鼠；人胃癌细胞株；抑制作用；凋亡
EGCG inhibition on growth of human gastric carcinoma cell SGC-7901 and xenograft in nude mice
LIU Chong-yuan，LUO Zhao-yang，Cao Juan，et al.
Cancer Research Institute，Nanhua University，Hengyang，Hunan 421001，China
【Abstract】 Objective To observe the effect of tea (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on antiproliferative effect in human gastric carcinoma cell strain SGC-7901 and further explore the effect of EGCG on the human gastric carcinoma cells inoculated into BALB/C nude mice. Methods Antiproliferative effect of EGCG against human gastric carcinoma cell lines was tested by MTT method. Antitumor effect of EGCG was determined using the xenografts models of human gastric carcinoma cell SGC-7901 in nude mice. The apoptosis of the xenograft preparations was examined by using the terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP biotin end labeling of fragmented DNA (TUNEL) and immunohistochemical staining.Results The fifty percent inhibition concentration (IC50)of EGCG against SGC-7901 cell were calculated to be 58.68 μg/ml. Average inhibitory rates of EGCG against xenograft tumors of human gastric carcinoma in nude mice were 34.51% (P＜0.05)，under the dosage of 5mg/(kg·d) ip×20d. Under the dosages of 10mg/(kg·d) ip×20d and 20mg/(kg·d)，ip×20 average inhibitory rates were 45.81% and 54.64%(P＜0.01)，respectively. The apoptosis of human gastric carcinoma cells in xenografts was enhanced，in which the positive cell number in EGCG5mg/kg、10mg/kg and 20mg/kg group were2.59±2.81、4.3±2.58 and 5.96±2.13，respectively by using TUNEL.Conclusion The results indicated that EGCG possessed different antiproliferative effect on human gastric carcinoma SGC-7901 cell lines in vitro. The growth inhibition of the xenograft tumor may involve in the apoptosis of tumor cells induced by EGCG.
【Key words】 EGCG; human gastric carcinoma cell line;nude mice; inhibition effect；apoptosis
胃癌是目前世界上位列第二的恶性肿瘤，在我国仍居消化道恶性肿瘤发病率的首位，约占全部恶性肿瘤的23%，尽管目前胃癌的防治工作已取得显著的成效，但许多病人仍死于手术后的复发和广泛转移。因此，对胃癌的浸润和转移的研究已成为当前的主要任务之一〖1〗。
茶叶富含多酚类化合物，茶多酚类化合物包括黄烷醇、黄酮类和茶多酚酸类，其中大部分为黄烷醇，通称儿茶素。主要的绿茶儿茶素有表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocateclin-3-gallate，EGCG) 、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)和表儿茶素(epicatechin，EC)，其中EGCG含量最高，占儿茶素的80%。大量的流行病学研究、体外实验及动物实验证实，茶多酚主要有抗氧化〖2〗、清除自由基〖3〗、抗炎、抗病毒〖4〗及抗突变和抗肿瘤〖5～7〗形成等生物学活性和药理效应，其中起主要作用的是EGCG。为了进一步了解EGCG对人胃癌的作用，本研究对胃癌SGC-7901细胞进行体外增殖抑制试验和对人胃癌裸鼠移植瘤的体内抗瘤试验，观察EGCG在体内对移植瘤生长抑制及细胞凋亡的影响，以进一步探讨其抗癌机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物 EGCG白色粉末，购自Sigma公司，纯度95%；MTT为 AMRESCO公司产品；5-FU为南通精华制药有限公司产品。
1.1.2 试剂 RPMI-1640 培养基为Gibco公司产品；小牛血清购于杭州四季青生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒（MK1022）购于武汉博士德生物工程有限公司；鼠抗人NF-kBp65单克隆抗体、SP超敏试剂盒、鼠抗人bcl-2单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司；DAB购于福州迈新生物技术有限公司。
1.1.3 细胞 人胃癌SGC-7901细胞从武汉大学中国典型培养物保藏中心引进。
1.1.4 动物 BALB/C裸小鼠，30只，3周龄，雄性，重量(15±2)g。由上海斯莱克实验动物有限公司提供（实验动物合格证号为SCXK（沪）2000A033）在无特定病原体2000B017（SPF）条件下饲养。
1.2 方法
1.2.1 MTT法 SGC-7901细胞培养于含体积分数为10%的灭活小牛血清，1×105U/L青霉素及1×105U/L链霉素的RPMI-1640培养基中，在体积分数为5%CO2的培养箱内培养传代，实验取对数生长期细胞。实验在96孔培养板中进行，每孔加入180μl单细胞悬液(每孔约0.8×104个细胞);每孔再加入以培养基稀释的药物20μl。设阴性对照组、阳性对照组和不同浓度的EGCG组，各组设6个平行孔，置37℃ 5%CO2培养箱中培养48h，实验终止前4h加入MTT液（5mg/ml）20μl/孔，调零组加入无血清RPMI- 1640培养基，混匀。继续培养4h，弃去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）溶液100μl/孔，震摇10min，使紫蓝色沉淀充分溶解，在（EX-800型）酶标仪下用调零孔校正零点，以570nm波长测定 A值，以6孔A值均数按以下公式算出生长抑制率（IR）：并以Mosmann求出半数抑制浓度 IC50〖8〗，实验重复3次。
IR%=（1-用药组平均A值/对照组平均A值）×100%
1.2.2 体内抑瘤实验 取对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞用胰酶消化后配成1×107个/ml 单细胞悬液，在无菌条件下于裸鼠背侧靠腋窝皮下接种0.2ml/只（相当于2×106个细胞），接种后5～6天可见肿瘤生长。用荷瘤鼠肿瘤的长短径按公式计算相似体积。肿瘤体积=1/2（长径×短径2），根据瘤体积大小顺排，将荷瘤鼠用随机区组设计分配分成5个组：(1)生理盐水对照组（NS）；(2)5-FU 20mg/(kg·d)组；(3)5mg/(kg·d) EGCG组；(4)10mg/(kg/d) EGCG组；(5)20mg/(kg·d) EGCG组。每组6只裸鼠，分组后，腹腔给药，每周用药4次，连用3周。每 3天测量瘤体积并称体重，停药次日量瘤体积、称体重、处死裸鼠，剥瘤块称瘤重，按以下公式计算抑瘤率，并作t检验。实验重复2次。各组按各时间点的平均瘤体积作生长曲线图。
抑瘤率（IR）=（1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%
1.2.3 TUNEL检测 把新鲜瘤组织及时固定于10%中性缓冲福尔马林中4h以上，石蜡包埋。严格按试剂盒说明书进行凋亡检测。结果判断：凋亡细胞胞核被染成紫蓝色。随机选取10个高倍镜视野，计数1000个肿瘤细胞中的凋亡细胞数，即凋亡指数。
1.2.4 免疫组化NF-kBp65和bcl-2的表达 将肿瘤切成0.3cm×0.5 cm×0.3cm大小，置于10%中性福尔马林中固定，常规石蜡切片，切片厚4μm。具体步骤为:(1)石蜡切片常规脱蜡水化;(2)置10mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，用微波处理以修复抗原，凉至室温;(3)PBS洗3×5min;(4)3%(体积分数)甲醇双氧水阻断10min后，PBS洗3×5min；(5)10%(体积分数)血清室温下封闭20min后，倾去血清，滴加一抗，室温下孵育60min;(6)PBS洗3×5min后，滴加二抗(生物素化的IgG)，室温下孵育20min;(7)PBS洗3×5min后，DAB显色;(8)自来水冲洗，苏木素复染;(9)脱水、透明、封片。
2 结果
2.1 体外对人胃癌SGC-7901细胞生长抑制作用 20、40、60、80、100μg/ml EGCG对SGC-7901细胞生长抑制率见图1，其IC50分别为21.7、32.8、52.5、61.3和66.5μg/ml（见表1），阳性药物对照组（5-FU 浓度设置为1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）对人胃癌SGC-7901细胞的IC50依次为22.58、31.15、38.05、47.24、50.34、53.94μg/ml(见表2)。图1 不同浓度的EGCG对人胃癌SGC-7901
细胞的生长抑制表1 EGCG对人胃癌SGC-7901细胞的半数抑制浓度IC50（48h，n=6）表2 5-FU对人胃癌SGC-7901细胞的半数抑制浓度
2.2 对人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤的作用 5mg/(kg·d)、10mg/(kg·d)和20mg/(kg·d)EGCG作用3周对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤的平均抑瘤率分别为34.51%、45.81%和54.64%（见表3），对SGC-7901裸鼠移植瘤体积生长的影响见图2。结果可见不同剂量的EGCG 对人胃癌裸鼠移植瘤均有不同程度的抑制作用，抑制作用与剂量相关。
表3 EGCG对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤的移植率
图2 EGCG对人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生长的影响2.3 EGCG对裸鼠移植瘤人胃癌细胞凋亡的影响 见表4。生理盐水组细胞凋亡指数为2.39±2.42，EGCG 5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg组凋亡指数分别为2.59±2.81、4.3±2.58和5.96±2.13，5-FU组凋亡指数为5.13±2.75。EGCG 5mg/kg组与生理盐水组比较差异无显著性（P＞0.05）; 10mg/kg和20mg/kg组与生理盐水组比较差异有显著性（P＜0.01）。表4 EGCG对裸鼠移植瘤人胃癌细胞凋亡的影响
2.4 免疫组化
2.4.1 NF-kBp65阳性判定 NF-kBp65阳性产物呈棕黄色细颗粒状，主要定位于肿瘤细胞浆和核膜。在高倍镜下进行计数，计数100个细胞，表达强度依照阳性产物着色强度按Handel的分级标准记分〖9〗：阴性<5%，阳性≥5%。见图3。
2.4.2 bcl-2阳性判定 bcl-2阳性染色定位于癌细胞胞浆内，胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每例切片计数100个细胞，按标记指数=(阳性癌细胞数/计数细胞数)×100%分为:<25%、25%～50%、>50%。见图4。
3 讨论
茶叶提取物具有多种生理活性和药理作用，目前国内外许多研究表明茶叶水、茶叶末及绿茶提取物有防癌和抗癌作用。绿茶有效成分EGCG对肿瘤的生长不仅具有明显的抑制作用，还是很强的抗氧化剂，能防止自由基损伤DNA大分子和引起脂质过氧化作用及通过对基因的调控，抑制与癌发生的相关基因的表达，达到防癌和抗促癌作用〖10～12〗，亦可通过抑制DNA复制相关酶（如DNA TopoⅡ）的活性，或抑制核苷转运而影响DNA合成，或通过提高机体免疫功能，诱导细胞凋亡等作用抑制癌细胞的生长和繁殖而发挥抗癌作用〖13，14〗。许多化学致癌物能诱发和促进肿瘤的形成，EGCG对肿瘤形成的各个阶段都有预防和抑制作用〖15〗。在离体细胞试验中，茶多酚除了能诱导肿瘤细胞凋亡外〖16〗，还能抑制多种肿瘤细胞的增殖〖17〗。在大量动物模型中，绿茶或EGCG不仅可抑制多种肿瘤的形成，还可以降低已形成的肿瘤的数目，减少肿瘤的大小。
本实验结果表明，EGCG对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞有不同程度的增殖抑制作用；对体内人胃癌裸鼠移植瘤有抗瘤作用。EGCG对SGC-7901人胃癌细胞的IC50值为58.60μg/ml，用5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg EGCG对SGC-7901胃癌细胞皮下移植瘤的生长抑制率平均值分别为34.51％、45.81%、54.64%，说明EGCG是非细胞毒类药物，故在体外对癌细胞直接杀灭作用不很强，而在体内抗瘤试验显示强的抗瘤活性，可能是EGCG吸收后在体内转化为具有抗瘤活性更强的物质或与EGCG多种多样的生理功能和药理作用相互协调作用有关。从TUNEL实验观察到，低剂量EGCG无诱导细胞凋亡作用，中、高剂量EGCG诱导细胞凋亡作用明显。这说明EGCG诱导人胃癌细胞凋亡的作用与剂量有相关性，与EGCG的抑瘤作用一致。提示EGCG抑制肿瘤的机制可通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。
NF-kBp65是一种重要的核转录因子，存在于多种细胞中，参与细胞内信号传导，调控多种基因表达。多种因素可以激活NF-kBp65，包括脂质过氧化激活。NF-kBp65的异常激活或完全抑制与多种疾病的发生发展有关，研究认为它可以促进细胞凋亡;而bcl-2是一种抗凋亡蛋白。NF-kBp65诱导的凋亡是bcl-2依赖性的，活化的NF-kBp65通过抑制了的bcl-2表达而促进了细胞的凋亡〖18〗。这可能解释了本研究中EGCG组较生理盐水组NF-kBp65表达减弱而bcl-2表达增强的原因。EGCG抑制NF-kBp65的活性，解除对bcl-2表达的抑制，于是bcl-2过表达抑制肿瘤细胞凋亡。最近Jung报道〖19〗，EGCG通过阻断血管内皮细胞生长因子的产生，抑制血管的生成，从而抑制了HT-29人结肠癌细胞在BALA/C裸小鼠体内的生长，同时诱导肿瘤细胞和血管内皮细胞的凋亡明显增加。虽然本研究只是实验研究，EGCG体内外抗肿瘤活性强而毒性小，具有临床肿瘤治疗新药开发前景。
【参考文献】
1 Jiwajinda S，Santisopasri V，Murakami A，et al. Suppressive effects of edible thai plants on superoxide and nitric oxide generation. Sian Pac J Cancer Prev，2002，3(3):215-223.
2 De Clercq E. Current lead natural products for the chemotherapy of human immunodeficiency virus(HIV) infection. Med Res Rev，2000，20(5):323-349.
3 Villar IC，Jimenez R，Galisteo M，et al. Effect of chronic chrysin treatment in spontaneously hypertensive rats. Planta Med，2002，68(9):847-850.
4 Takao S，Shimazu H，Menohara S，et al. Tumorigenicity and metastasis of human gastric cancer in nude mice. J Cancer Res Clin Oncol，1991，117:533.
5 Yang CS，Chung JY，Yang G，et al Tea and polyphenols in cancer prevention.Nature，2000，130（2S Suppl）：472-478.
6 谢冰芬，刘宗潮，赫东磊，等.茶多酚细胞毒作用和抗癌作用的研究.癌症，1997，17（6）：418-420.
7 Yang CS，Wang ZY. Tea and cancer.J Natl Cancer Inst，1993，85:1038.
8 Zheng X，Meng WD，Qing FL，et al. Synthesis and anticancer effect of chrysin derivatives. Bioorg Med Chem Lett，2003，13(5):881-884.
9 Handel ML，Mcmorrow LB，Gravallese E M，et al.NF-KB in rheumatoid synovium.Arthritis Rheum，1995，38(9):1762-1770.
10 McCarty MF.Med Hypothesis，1999，50(6):511-514.
11 Ishibashi M，Fujita M，Nagai K，et al. Production and secretion of endothelin by hepatocellular carcinoma. J Clin Endocrinol Metab，1993，76(2):378.
12 Giaid A. Detection of endothelin immunoreactivity and mRNA in pulmonary tumors.J Pathol，1990，162(1):15.
13 Yamashita J，Ogawa M，Inada K，et al. A large amount of endothelin-1 is present in human breast cancer tissues. Res Commun Chem Pathol Pharmacol，1991，74:363.
14 Yang CS，Chung JY，Yang G，et al.Tea and tea polyphenols in cancer prevention.Natr，2000，130:472-478.
15 Fujiki H. J Cancer Res Clin Oncol，1999，125(11):589-597.
16 Tan X，Hu D，Li S，et al.Different of four catechins in cell cycle arrest and induction of apoptosis in LoVo cells.Cancer Lett，2000，158(1):1-6.
17 Battistini B，Chailler P，Orleans-Juste P，et al. Growth regulatory properties of endothelins. Peptides，1993，14:385.
18 Sohur US，Dixit MN，Chen CL. NF-kppa B represses bcl-2 transcription in pro-B lymphcytes.Gene Express，1999，8(4):219-229.
19 Jung YD，Kim MS，Shin BA，et al. EGCG，A major component of green tea，inhibits tumour growth by inhibiting VEGF induction in human colon carcinoma cells. Br J Cancer，2001，84(6):844-850.
作者单位： 421001 湖南衡阳，南华大学肿瘤研究所(Δ通讯作者)