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【摘要】 目的 观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对人胃癌细胞系（SGC－7901）裸鼠移植瘤生长及其血管生成的抑制作用，并探讨其分子机制。方法 采用人胃腺癌（SGC-7901）细胞裸鼠异种移植瘤模型，评价EGCG治疗人胃癌的有效性。间接免疫荧光标记流式细胞术检测移植瘤血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况；免疫组化检测移植瘤中VEGF、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表达； Western blot分析不同浓度EGCG对细胞核转录因子NF-κB（P65）的表达情况。结果 间接免疫荧光标记的流式结果显示EGCG对VEGF的表达有浓度依赖性抑制作用。免疫组化VEGF和MMP-2蛋白的表达率与肿瘤侵入血管的程度有关；Western blot分析表明核转录因子NF-κB（P65）蛋白表达随EGCG浓度的升高而降低。结论 EGCG能抑制移植瘤新生血管形成，从而抑制裸鼠移植瘤的体内生长。
【关键词】 EGCG；人胃腺癌SGC-7901细胞；裸鼠；VEGF； MMP-2
Experimental study on VEGF expression and MMP-2 activation in transplanted tumor inhibited by EGCG in vivo
CAO Juan, LUO Zhao-yang, ZHOU Wei,et al.
Cancer Research Institute, Nanhua University, Hengyang, Hunan 421001,P.R.China
【Abstract】 Objective To observe growth inhibition and expression level of vascular endothelial growth factor(VEGF)in tumor tissue transplanted with human gastric carcinoma cell line （SGC-7901）by epigallocatechin-3-gallate (EGCG)in vivo as well as approach molecule mechanism. Methods Antitumor effect of EGCG was determined using the xenografts models of human gastric carcinoma cell SGC-7901 in nude mice. The expression of VEGF in xenograft tumor cells was analyzed by indirect immunofluorescence. The expression of VEGF and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in tumor tissues was examined by using immunohistochemical staining method. Protein expression of nuclear factor-KBP65(NF-κBP65) were observed by Western blot in different groups. Results The expression of VEGF in dose-dependant manner, which were observed by indirect immunofluorescence.Expression of VEGF and MMP-2 was higher in tumor tissues in relation to the extent of vascular invasion. Western blot analysis the expression of NF-κB（P65）protein in xenograft tumor is decreasing as adding the concentration of EGCG.Conclusion EGCG inhibits angiogenesis in human gastric carcinoma transplanted in mice so that growth of transplanted tumor can be inhibited in vivo.
【Key words】 EGCG; human gastric carcinoma cell line; nude mice; VEGF； MMP-2
近40年来在肿瘤领域研究的重大进展之一是确立了肿瘤血管生成在肿瘤发展中的重要地位与抗血管生成治疗肿瘤的意义［1,2］。当肿瘤长到1～2mm时,必须有新生血管来提供肿瘤不断生长所需的营养,同时由于肿瘤诱导产生的新生血管结构异常,如基膜不完整、血管壁很薄且易通透,使肿瘤细胞易于侵入到这种血管内,所以肿瘤新生血管的形成不仅是肿瘤可持续性生长的基础,也为其侵袭和转移创造了十分有利的条件。在国内外已研究发现新生血管的形成与肿瘤细胞分泌和激活血管生长因子有关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一重要的血管生长因子,在实体瘤的血管形成中起重要作用［3］。近年发现基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2) 亦与血管生成有关,它通过降解细胞外基质(Extracellur matrix,ECM)而促进肿瘤的转移。VEGF在促血管生成过程中可增加内皮细胞MMP-2的表达,更有助于肿瘤的浸润和转移。
流行病学、动物实验及体外研究结果表明，绿茶提取物具有一定程度的抑癌或防癌作用［4，5］。有文献报道EGCG对体内裸鼠移植瘤生长有抑制作用［6］；EGCG还能抑制肿瘤细胞诱导的血管新生［7］。本实验观察EGCG对人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤抗血管生成作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物 EGCG购自Sigma公司，纯度95%；米诺环素（ Minocycline）购自Sigma公司，纯度98%；5-FU为南通精华制药有限公司产品。
1.1.2 试剂 RPMI-1640培养基为Gibco公司产品；鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人MMP-2单克隆抗体、鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司； SP超敏试剂盒、DAB购于福州迈新生物技术有限公司。
1.1.3 细胞 人胃癌SGC-7901细胞从武汉大学中国典型培养物保藏中心引进。
1.1.4 动物 BALB/C裸小鼠，36只，3周龄，雄性，重量(15±2)g。由上海斯莱克实验动物有限公司提供［实验动物合格证号为SCXK（沪）2000A033］，在无特定病原体2000B017（SPF）条件下饲养。
1.2 方法
1.2.1 移植瘤动物模型的构建［8］ 胃癌细胞株SGC-7901细胞培养于含体积分数为10%的灭活小牛血清,1×105U/L青霉素及1×105U/L链霉素的RPMI-1640培养基中,在37℃，体积分数为5%CO2的培养箱内培养传代,稳定传代15代以上。取对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞用0.25%胰酶消化后加入培养液，吹打细胞制成单细胞悬液，以1000r/min离心5min除去上清液，另加适量细胞培养液经台盼蓝染色和血细胞计数板计数，活细胞比率＞98%，细胞浓度为1×107个/ml时，在无菌条件下于裸鼠背侧靠腋窝皮下接种0.2ml/只（相当于2×106个细胞），接种后5～6天可见肿瘤生长。
1.2.2 动物分组及给药 接种后按随机区组分配设计分成6组,每组6只。(1)生理盐水对照组:每只注射0.2ml无菌生理盐水;(2)阳性药对照组: 5-氟尿嘧啶按20mg/kg剂量;(3)血管形成抑制剂阳性药对照组：米诺环素按10mg/kg剂量;(4)低剂量EGCG组: 按5mg/kg剂量;(5)中剂量EGCG组: 按10mg/kg剂量;(6)高剂量EGCG组: 按20mg/kg剂量,每组均隔日腹腔注射1次,注射10次。将EGCG和米诺环素分别溶解于灭菌的PBS中，抽滤后4℃保存，用药开始于接种后7天直至实验结束的前一天。
1.2.3 间接免疫荧光标记流式细胞术 鼠抗人VEGF单克隆抗体胞浆内染色步骤：(1)收集细胞悬液4%多聚甲醛固定，室温放置40min；(2)PBS洗1次，洗去固定液，摇匀，再加入1ml PBS（内含0.1% triton-100,5%小牛血清）冰上放置10min；(3)PBS洗2次，离心，将样品细胞分为两份；(4)一份染一抗VEGF（1：100），4℃，40min孵育;PBS洗去多余一抗，加入荧光素标记羊抗小鼠IgG，4℃，孵育40min; PBS洗去多余二抗，加入PBS至0.5ml,过300目尼龙网，流式细胞仪检测；(5)一份只染二抗作为阴性对照，其余操作同前一份。仪器为美国Coulter公司流式细胞仪，EPICS XL型选荧光单参数直方图平均荧光强度。
1.2.4 免疫组化VEGF和MMP-2的表达 肿瘤组织块0.3cm×0.5 cm×0.3cm大小，置于10%中性福尔马林中固定，常规石蜡切片，切片厚4μm。具体步骤参照说明书。
1.2.5 Western blot分析 Western blot观察EGCG组与生理盐水组中NF-κB(p65)蛋白的表达改变情况。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，用ECL发光法检测不同样品各种蛋白表达状况，薄层扫描仪（日本，型号CS－930）测定印迹区带的光密度值。为了确保每组所加蛋白为等量，同一张膜显影后重新封闭再孵一抗β-actin。
1.2.6 统计学方法 各组数据采用(x±s)表示,根据数据类型分别采用ｔ检验,应用SPSS11.5分析。
2 结果
2.1 EGCG对人胃癌细胞裸鼠移植瘤血管内皮生长因子（VEGF）的抑制作用 间接免疫荧光标记流式术证实20mg/kg、 10mg/kg组和 5mg/kg 组EGCG均能抑制人胃癌细胞裸鼠移植瘤组织中VEGF的表达；以EGCG20mg/kg 组抑制作用最明显。见表1。
表1 EGCG对移植瘤血管内皮生长因子（VEGF）间接免疫荧光标记流式的结果（略）
2.2 EGCG抑制人胃癌裸鼠移植瘤模型血管内皮生长因子及基质金属蛋白酶-2 的表达
2.2.1 VEGF阳性判定 VEGF染色阳性以细胞浆呈现棕黄色颗粒状染色为标准。免疫组化证实EGCG 10mg/kg组VEGF表达低于生理盐水组VEGF表达。见图1。
2.2.2 MMP-2阳性判定 MMP-2以镜下细胞浆和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。见图2。从图2见EGCG 10mg/kg组MMP-2表达低于生理盐水组MMP-2表达。
2.3 Western blot分析不同浓度EGCG组对细胞核转录因子NF-κB（P65）表达的抑制 EGCG三个浓度处理核转录因子NF-κB(p65)蛋白表达均较生理盐水对照组有下降，其中EGCG20mg/kg组下降最明显。见图3、图4（1 生理盐水；2 5-FU；3 米诺环素；4 EGCG5mg/ml；5 EGCG 10mg/ml；6 EGCG20mg/ml）。
3 讨论
血管生成对肿瘤细胞进入血液循环是必需的，它增加了肿瘤细胞进入循环和发生转移的可能性。与血管生成有关的因子有30多种,其中VEGF是最重要的促血管生成因子,可作为肿瘤代谢及转移标记［9］。VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素,具有双重功能,既增加微血管通透性,又通过与内皮细胞上2个特殊受体flt和flt/KDR作用,直接刺激内皮细胞增殖,并产生纤维蛋白溶解酶原激活剂和胶原酶［10，11］,促进血管形成、肿瘤细胞脱落进入血管及向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散。间接免疫荧光标记的流式证实高、中、低浓度EGCG均能抑制人胃癌裸鼠移植瘤组织中VEGF的表达，而EGCG 20mg/kg 组抑制作用最明显。说明EGCG 通过抑制VEGF的表达而抑制了血管的形成。
MMP-2是一种锌离子依赖性的蛋白酶,分子量为72kD。以酶原形式分泌,Ⅰ型膜型MMP (membrane type Ⅰ MMP，MTI-MMP)可将其激活,被激活后的MMP-2能水解细胞基底膜及外基质中Ⅳ型、Ⅴ型胶原和纤维连接蛋白成分,导致基底膜破坏、肿瘤细胞浸润结缔组织基质、侵入小血管和淋巴管而发生转移。本实验证实裸鼠移植瘤生理盐水组MMP-2的阳性率明显高于EGCG 10mg/kg组，说明MMP-2在胃癌的发展、浸润和转移过程中发挥了重要作用。综上所述,VEGF与MMP-2表达是反映胃癌生物学行为的重要标志, EGCG具有抑制MMP酶的活性，通过抑制MMP-2蛋白、下调VEGF表达而抑制胃癌的形成和浸润转移。
核转录因子NF-κB(p65)是一种重要的可诱导的基因转录调节因子。近年研究表明NF-κB调节许多黏附、侵袭、迁移相关因子的转录而参与肿瘤的侵袭转移［12］。多种因子通过NF-κB在胃癌细胞株及胃癌组织中持续活化参与胃癌的进展［13］。本实验蛋白质印迹显示,5mg/kg组、10mg/kg组、20mg/kg组EGCG处理裸鼠后，NF-κB(p65)的表达随EGCG浓度的增加而减少，这从蛋白质水平证实EGCG能有效抑制NF-κB(p65)表达。
茶叶富含多酚类化合物,茶多酚类化合物包括黄烷醇、黄酮类和茶多酚酸类,其中大部分为黄烷醇,通称儿茶素。主要的绿茶儿茶素有表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocateclin-3-gallate,EGCG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-gallate,ECG)和表儿茶素(epicatechin,EC),其中EGCG含量最高,占儿茶素的80%。茶多酚抗突变和抗肿瘤形成等生物学活性和药理效应,起主要作用的是EGCG。本实验结果表明EGCG是通过抑制MMP-2和VEGF的表达而抑制肿瘤血管的形成，而抑制肿瘤生长；EGCG抗瘤活性强而毒性较小，具有临床肿瘤治疗新药开发前景。
(本文图片见封三)（略）
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(编辑：李 木)
作者单位：421001 湖南衡阳，南华大学肿瘤研究所(Δ通讯作者)