去甲肾上腺素对THP-1源性巨噬细胞SR-A1表达的影响

　　【摘要】  目的  探讨去甲肾上腺素对人THP-1源性巨噬细胞SR-A1表达的影响。方法  不同浓度的去甲肾上腺素（10pmol/L～10 μmol/L）作用THP-1源性巨噬细胞24h，运用逆转录多聚酶链反应检测其SR-A1 mRNA的表达。Western 印迹检测SR-A1蛋白的表达。结果  1 μmol/L及10 μmol/L的去甲肾上腺素作用THP-1源性巨噬细胞后，其SR-A1 mRNA和蛋白水平上升（P＜0.05）。结论  应激状态的去甲肾上腺素能升高THP-1源性巨噬细胞SR-A1基因的表达。

　　【关键词】  去甲肾上腺素； THP-1源性巨噬细胞； SR-A1

　　　Effects of noradrenaline on SR-A1 expression in human THP-1 macrophage cells

　　CHEN Guang-Jun，  GUO Xiao-Fang，  XIAO Rong,et al.

    　Emergency Medical Center，Second People’s Hospital of Yueyang, Hunan 414000,China

　　【Abstract】  Objective  To investigate the effect of noradrenaline on the expression of SR-A1 in human THP-1 macrophage cells.Methods  We use the different concentrations of noradrenalin（10 pmol/L～10 μmol/L）which incubate with THP-1 macrophage cells 24 hours. then the mRNA levels of SR-A1 were determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Western-blot analysis were used to dectect protein level of SR-A1.Results  THP-1 macrophage cells is treated with 1μmol/L and 10 μmol/L noradrenalin, the mRNA and protein levels of SR-A1 increase（P＜0.05）.Conclusion  Stress concentrations of noradrenalin cause SR-A1 expression increased in human THP-1 macrophage cells.

　　【Key words】  noradrenaline; human THP-1 macrophage cells; SR-A1

　　应激定义为机体在心理、环境或者物理应激原刺激下，激活下丘脑－垂体－肾上腺轴和交感神经系统导致生理的变化或适应［1～5］。反复的或者慢性应激与急性反应物质能共同促进炎症反应，激活巨噬细胞产生自由基，修饰脂质，转变为泡沫细胞和激活凝血途径形成稳定或者不稳定的斑块。因此从细胞水平探究应激性心理社会因素是否参与动脉粥样硬化的过程意义重大。本研究以THP-1巨噬细胞为研究对象, 观察去甲肾上腺素对THP-1源性巨噬细胞SR-A1基因表达的影响, 以探究应激性心理社会因素在动脉粥样硬化泡沫细胞形成中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器和试剂  人单核细胞THP-1由中国科学院上海细胞库提供；逆转录多聚酶链反应试剂盒为美国Promega公司产品；Trizol为Invitrogen公司产品；2×Taq PCR MasterMix为北京天为时代公司产品；鼠抗人SR-A1多克隆抗体及为Santa Cruz公司产品； SR-A1和GAPDH引物均由上海生物工程公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.2  细胞培养分化与去甲肾上腺素处理  人单核细胞系THP-1细胞（购自中国科学院上海细胞库），使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每3天传代1次。于传代后第1天收集细胞，以4×106个接种于25cm2培养瓶，每瓶含8ml培养基，再加入8μl 100 μmol/L 佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）使PMA终浓度为100 nmol/L，37℃、5%CO2的培养箱中培养3天，显微镜下观察显示此时细胞呈贴壁状态，形状不规则并有伪足伸出，证实THP-1细胞已分化为巨噬细胞，此时更换为含去甲肾上腺素的无血清培养液，各组去甲肾上腺素终浓度为：对照组0，1组10 pmol/L，2组100 pmol/L，3组1nmol/L，4组10 nmol/L，5组100 nmol/L，6组1μmol/L，7组10μmol/L，在37℃、5% CO2的培养箱中孵育24h。

　　1.3  逆转录聚合酶链反应  收集各组THP-1源性巨噬细胞。按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明书提取细胞总RNA。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测RNA的纯度和浓度。取2μg各组细胞总RNA逆转录合成cDNA，再取1μl逆转录产物进行PCR循环。94℃预变性4min，94℃变性1min，退火：GAPDH 60℃ 30s，SR-A1 59℃ 1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。循环数：GAPDH 28个循环， SR-A1 34个循环。人GAPDH的引物序列：上游5′-tgtcgctgttgaagtcagag-3′； 下游5′-tcaccatcttccaggagcgag-3′。产物长度为696 bp。人SR-A1的引物序列：上游5′-ctcctgaagtgggaaacgaag-3′； 下游5′-gaggttggcttccatgtctaa-3′。产物长度为183bp。取PCR产物6μl上样于2％琼脂糖凝胶，90V电压，电泳1h后在紫外可见分析装置下拍照。图像采用凝胶成像分析系统获得3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和目的条带的平均灰度值，以目的条带/GAPDH比值变化来衡量各基因表达的相对变化。

　　1.4  Western-blotting印迹法检测SR-A1蛋白的表达  收集不同条件处理的细胞，MBST裂解液裂解细胞，于4℃，5000 rpm离心10min去除沉淀，BCA法测定蛋白含量，取50 μg蛋白加入4×SDS凝胶加样缓冲液中调整蛋白浓度使各组一致，在100℃加热10min使蛋白质变性。配置5％的积层胶和10％SDS-PAGE分离胶电泳分离。90V恒压电泳3h，转移至PVDF膜上，丽春红染色观察转移效果，确定蛋白分子量标准的位置。室温下用含5%脱脂奶粉的TBST（20 mmol/L Tris base pH 7.6，50 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20）阻断液封闭1h，按1:100加入鼠抗人SR-A1一抗，4℃孵育过夜，TBST洗3次，按1:2000加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温孵育1h，TBST洗3次后用Western-blotting荧光检测试剂盒显示结果于标准X线片。结果用凝胶图像分析系统分析软件对胶片扫描，以对照组的面积灰度值为100％与实验组进行比较和半定量分析。实验重复3次。

　　1.5  统计学方法  所得数据用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS13.0软件进行统计学处理，全部数据经方差齐性分析后，采用单因素方差分析或配对t检验进行显著性检验，P＜0.05判断数据有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  去甲肾上腺素对SR-A1 mRNA表达的影响  为了探讨去甲肾上腺素是否影响THP-1源性巨噬细胞SR-A1 mRNA表达。 我们采用RT-PCR检测THP-1源性巨噬细胞SR-A1 mRNA的表达。结果如图1所示，1 μmol/L及10 μmol/L的去甲肾上腺素作用于THP-1源性巨噬细胞其SR-A1 mRNA水平分别上升47.3%和52.1%，与对照组比较其差异有显著性。

　　2.2  去甲肾上腺素对SR-A1蛋白表达的影响  为了探讨去甲肾上腺素是否影响THP-1源性巨噬细胞SR-A1蛋白表达。我们采用Western-blot检测THP-1源性巨噬细胞SR-A1蛋白的表达。结果如图2所示，1μmol/L及10 μmol/L的去甲肾上腺素作用于THP-1源性巨噬细胞其SR-A1 蛋白水平分别升高39.7%和45.6%，与对照组比较其差异有显著性。

　　3  讨论

　　心血管系统是心理应激的靶目标，最近的资料指出在下丘脑、垂体腺、肾上腺髓质和交感神经末端之间存在相互作用如同对应激的神经内分泌反应。许多证据表明心理社会因素参与一部分心血管疾病如AS的起病和进程［6,7］。反复的或者慢性应激与急性反应物质共同促进炎症反应，激活巨噬细胞产生自由基，修饰脂质，转变为泡沫细胞和激活凝血途径形成稳定或者不稳定的斑块。

　　清道夫受体（Scavenger receptor）主要存在于巨噬细胞，能结合氧化修饰低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，OxLDL）等多种配体，主要包括清道夫受体A类(Scavenger receptor class A，SRA)、CD36、macrosialin/CD68、SR-B1等。A类清道夫受体是细胞膜上的一种糖蛋白，广泛分布于巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等。能识别多种配基，主要包括多聚阴离子，如化学修饰的脂蛋白（OxLDL，AcLDL）、多聚核苷酸、多糖等成分。SR-A具有多种生物学功能，在动脉粥样硬化的发生和发展中也有重要的作用［8］。为了解应激对THP-1巨噬细胞SR-A1表达的影响，我们用10 pmol/L～10 μmol/L的去甲肾上腺素处理细胞，观察到1 μmol/L及10 μmol/L的去甲肾上腺素作用THP-1巨噬细胞其SR-A1 mRNA水平分别升高47.3%和52.1%。去甲肾上腺素作用后其蛋白水平的变化与mRNA水平的变化一致。表明应激水平的去甲肾上腺素能显著升高THP-1巨噬细胞SR-A1基因的表达。提示我们应激状态导致的去甲肾上腺素水平的升高可能通过上调SR-A1基因的表达而促进细胞对氧化修饰LDL的摄取，进而加速巨噬细胞泡沫化的进程，参与AS的发生发展。

　　 因此，我们认为心理应激状态导致儿茶酚胺类激素去甲肾上腺素水平升高，能影响巨噬细胞SR-A1基因的表达，从而加速动脉粥样硬化的进程，这可能为进一步研究应激和心血管疾病之间的连接机制提供了新的思路。

　　(本文图片见封三)

　　【参考文献】

　　1  Peterson PD, Chan CC, Molitor M. Stress and pathogenesis of infectious disease. Rev Infect Dis，1991，13:710-713.

　　2  Chrousos GP, Gold PW. The concepts of stress and stress system disorders. Overview of physical and behavioral homeostasis. J Am Med Assoc，1992，267:1244-1252.

　　3  Black PH. Immune system-central nervous system interactions:effect and immunomodulatory consequences of immune system mediators on the brain. Agents Chemother，1994，38:7-12.

　　4  Black PH. Central nervous system-immune system interactions:pyschoneuroendocrinology of stress and its immune consequences.Antimicrob Agents Chemother，1994，38:1-6.

　　5  Black PH, Garbutt LD. Stress, inflammation and cardiovascular disease. J Psychosom Res，2002 Jan，52(1):1-23.

　　6  Lynch JW, Everson SA, Kaplan GA, et al. Does low socioeconomic status potentiate the effects of heightened cardiovascular responses to stress on the progression of carotid atherosclerosis? Am J Public Health，1998，88:389-394.

　　7  Rozanski A, Blumenthal JA, Kaplan J. Impact of psychological factors on the pathogenesis of cardiovascular disease and implications for therapy. Circulation，1999，99:2192-2217.

　　8  De Winther MP, van Di jk KW, Havekes LM, et al. Macrophage scavenger receptor class A:a multifunction receptor in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20(2):290-297.

　　 作者单位：414000 湖南岳阳，岳阳市第二人民医院120急救中心(Δ通讯作者)

　　 (编辑：悦  铭)