补肾活血化痰法对拟血管性痴呆小鼠脑组织中NO、NOS及Glu的影响

　　补肾活血化痰法对拟血管性痴呆小鼠脑组织中NO、NOS及Glu的影响(pdf)

    【摘要】  目的  观察补肾活血化痰法对拟血管性痴呆小鼠脑组织中NO、NOS及Glu的影响，进而探讨该法的作用机制。方法  复制脑部缺血再灌注拟血管性痴呆小鼠模型。术后15天检测各组小鼠脑组织内一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、谷氨酸（Glu）的含量。结果  补肾活血化痰组小鼠脑组织内NO、NOS、Glu含量明显降低 (P＜0.05～0.01)。结论  补肾活血化痰法能够抑制小鼠缺血脑组织中Glu的释放，进而降低NOS活性、减少NO合成，从而保护神经元，这可能是补肾活血化痰法治疗VD的部分作用机制。

    【关键词】  血管性痴呆；补肾活血化痰法；小鼠；NO；NOS；Glu

      Effects of kidney-invigorating，blood-promoting and phlegm-dissipating on No，NOS and Glu contents of brain tissues of mice with analog vascular dementia

    WANG Ya-li，HOU Xian-ming，NIU Bing，et al.TCM College，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China

    【Abstract】  Objective  To observe the effects of kidney-invigorating，blood-promoting and phlegm-dissipating on NO，NOS and Glu contents of brain tissues of mice with analog vascular dementia，and to further explore the action mechamism of this method.Methods  The model mice with analog vascular dementia were duplicated through ischemia-reperfusion in the brain.15 days after the operation，NO，NOS and Glu contents in the brain tissue of mice in all groups was detected.Results  In the kidney-invigorating，blood-promoting and phlegm-dissipating group，NO，NOS and Glu contents in the brain tissue obviously lowered (P＜0.05～0.01).Conclusion  Kidney-invigorating，blood-promoting and phlegm-dissipating is able to protect neurons through inhibiting the release of Glu in the brain tissues of mice，further  lowering the activity of NOS and reducing the sythesis of NO.This may be part action mechanism of this method to treat VD.

    【Key words】  vascular dementia; kidney-invigorating，blood-promoting and phlegm-dissipating; mouse; NO；NOS；Glu

    血管性痴呆（VD）是因脑血管疾病所致的智能及认知功能障碍临床综合征。临床表现以伴发脑血管病而发生痴呆为特征。VD的发展有逐年增高的趋势，已经成为中老年人群中的常见病、多发病。中医药治疗VD具有丰富的实践经验，在延缓病情进展、改善病人全身症状，一定程度上改善智能状态等方面表现出优势。本实验通过复制血管性痴呆小鼠模型，观察临床常用的补肾、活血、化痰三法组合后对小鼠脑组织中NO、NOS及Glu的影响，进而探讨该法的作用机制，为中医临床提供科学实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  清洁级雄性昆明小鼠70只，体重25～28g，购于河北医科大学实验动物中心。合格证编号：DK0510024。

    1.2  实验药品  依舒佳林（喜德镇）：意大利宝利化大药厂制，中国进口药品注册编号：X20010220；水合氯醛：上海五联化工厂，批号：20040614，用时配制成50 mg/ml溶液；中草药购于石家庄市乐仁堂，并由河北医科大学中医学院中药教研室鉴定均属正品。补肾活血化痰药组方为：熟地、山萸肉、枸杞、制首乌、菟丝子、桃仁、红花、当归、川芎、丹参、制半夏、炙远志、石菖蒲、胆南星、枳实各15g；以上中药水煎2次后合并滤液，文火浓缩，浓度为(含生药)4.0g/ml。

    1.3  试剂及仪器  NO试剂盒、NOS试剂盒、Glu试剂盒：均购自南京建成生物工程研究所。FA2004型上皿电子天平（上海精科天平仪器厂）；721型可见光分光光度计（上海第三分析仪器厂）；722光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂）；MSE-25型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

    1.4  实验方法

    1.4.1  分组与用药  小鼠适应性饲养1周后，随机分为4组。即假手术组（A）、模型组（B）、补肾活血化痰组（C）、喜得镇组（D）。各组均于术前10天开始灌胃，灌胃量为1ml/100g，假手术组和模型组灌服等量生理盐水，每天1次。手术当天提前2h灌胃，直至术后15天。

    1.4.2  动物模型制备  根据文献［1］，将动物用水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，消毒，颈正中切口，体视显微镜下分离双侧颈总动脉，套4号丝线扣备用。拉紧丝扣，阻断血流20min，同时在距尾尖1cm处剪断放血约0.3ml，热凝止血。松开丝扣灌注10min后，再次阻断血流20min，第2次再灌后观察30min，缝合皮肤。术后每日肌注青霉素0.2万U，连续3天。其中假手术组只分离颈总动脉，套丝扣，但不阻断血流，尾部不放血，观察时间等与其他组相同。

    1.5  观测指标  NO、NOS、Glu含量：将各组小鼠分批断头，冰盘上快速剖取全脑，弃去嗅球及小脑。用冰生理盐水冲洗血液，再用滤纸拭干，电子天平称重后加入9倍冷生理盐水，在玻璃匀浆器中研磨成10%匀浆，4℃、3600r/min离心5min，提取上清液，-20℃冻存待检。脑组织中NO、NOS、Glu含量的测定严格按照试剂盒说明书操作。

    1.6  数据处理  数据用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.5统计软件先进行方差齐性检验，再用单因素方差分析；组间比较方差齐时用SNK-q检验，方差不齐时用Dunnett’s T3检验。检验水准α=0.05或0.01。

    2  结果

    2.1  补肾活血化痰法对小鼠脑组织中NOS、NO的影响  模型组与假手术组相比，小鼠脑组织中NOS、NO含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，补肾活血化痰组小鼠脑组织中NOS、NO含量显著降低(P＜0.05～0.01)；喜得镇组与补肾活血化痰组比较差异无显著性(P＞0.05) (见表1)。表1  补肾活血化痰法对拟血管性痴呆小鼠脑组织中NOS、NO含量的影响 注：与A组比较，■P＜0.01；与B组比较，*P＜0.01

    2.2  补肾活血化痰法对小鼠脑组织中Glu的影响  模型组与假手术组相比，小鼠脑组织中Glu含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，补肾活血化痰组小鼠脑组织中Glu含量显著降低(P＜0.05～0.01)；喜得镇组与补肾活血化痰组比较差异无显著性(P＞0.05) (见表2)。表2  补肾活血化痰法对拟血管性痴呆小鼠脑组织中Glu含量的影响  注：与A组比较，■P＜0.01；与B组比较，*P＜0.01；▲P＜0.05

    3  讨论

    中医药对血管性痴呆的临床治疗具有肯定的疗效，其复方药效的特点是多层次、多环节、多途径、多靶点的整体调节。为了探讨补肾活血化痰法治疗VD的部分作用机制，笔者根据大量临床报道，在分析本病的常用方及常用药的基础上，筛选了具有代表性的补肾、活血、化痰药物，以之组成补肾活血化痰方，对比观察其对血管性痴呆的防治效果。

　　兴奋性氨基酸（EAAs）是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，在生理情况下，EAAs及其受体在学习和记忆、神经元的可塑性、神经元生存以及树突的生长与退化、大脑发育、信息传递等方面均起重要作用。既往研究证实，Glu和Asp是脑内含量最多、毒性最强的EAAs，而NMDA受体广泛分布于中枢，在大脑皮层、海马、丘脑等部位密度较高，这些区域又恰是缺血易损区，在缺血缺氧时，Glu大量释放，同时其再摄取机制受阻，突触中Glu堆积。目前认为兴奋性毒性机制可能有两方面： EAAs大量释放，致神经细胞渗透性改变，K+外流，Cl-、Na+及水内流，引起神经细胞急性肿胀；另一方面，EAAs可使N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体过度兴奋，启动NMDA受体的钙通道而使钙离子大量内流，导致细胞内游离Ca2+浓度的异常升高，从而诱发神经细胞迟发性损害，最终导致神经元死亡，从而影响和破坏了大脑高级神经功能活动。

　　NO是一个能扩散的有高度化学活性的气体分子，是具有生理及病理双重作用的“双刃剑”。中枢神经系统中的NO可调节脑血流量，参与学习和记忆过程。脑缺血缺氧后，EAAs释放增加，过度激动NMDA受体，Ca2+通道开放，细胞内Ca2+超载，激活NOS，引起NO大量释放，过量的NO具有强神经细胞毒性作用，而且参与缺血性脑损害，在痴呆形成中可能发挥重要作用［2］。因此，本实验对拟血管性痴呆小鼠脑组织内NO、NOS、Glu含量的变化进行了研究。

　　结果证实，补肾活血化痰法可显著降低拟血管性痴呆小鼠脑组织中NO、NOS、Glu含量，提高小鼠学习记忆能力。提示：降低小鼠脑组织中NO、NOS、Glu含量，从而减轻Glu、NO对神经细胞的毒性来保护神经元、提高学习记忆能力可能是补肾活血化痰法治疗血管性痴呆的部分作用机制。中医学认为血管性痴呆是在精气亏虚的基础上产生瘀血、痰浊后形成的本虚标实、虚实夹杂之证，补肾活血化痰法补肾填精治其本，活血化痰治其标，标本兼顾，谨守病机，故对血管性痴呆有显著的防治作用。

    【参考文献】

    1  赵建新，田元祥，李国明，等.拟血管性痴呆小鼠模型皮层及海马细胞病理组织学动态观察.中国病理生理杂志，2000，16(11)： 1214-1216.

    2  Meyer RC，Spangler EL，Patel N，et al.Impaired learning in rats in a 14-unit T-maze by 7-nitroindazole，a neuronal nitric oxide synth-ase inhibitor，is attenuated by the nitric oxide donor，molsidomine.Eur J Pharmacol，1998，341(1)： 17-22.

     *基金项目：河北省科技开发资助项目(04276101D-70)

    作者单位：050091 河北石家庄，河北医科大学中医学院

　　 (编辑：悦  铭)