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【摘要】 目的 研究自体骨髓在兔腰椎横突间融合中的诱导成骨作用。方法 骨骼成熟的中国白兔24只，行双侧腰5~6椎体横突间植骨融合。实验组除植入髂骨外，取2ml自体骨髓植入融合区。不同时期处死动物，脊柱标本通过手工检测、X线片、CT测量成骨体积、组织学等方法分析。结果 各时期实验组手工检测、X线片、CT测量成骨块体积均高于对照组，组织学检查显示各时期实验组的成骨数量和新生骨的成熟度均高于对照组。结论 兔腰椎横突间融合模型中，自体骨髓是一种有效可靠的骨移植添加物，可在应用有限自体髂骨植骨的情况下，获得更好的融合效果。
【关键词】 脊柱融合；骨髓移植；兔；骨移植替代物
Experimental study on the inducement of bone marrow for rabbit lumbar intertransverse process spinal fusion
REN Yong-min，LI Xue-bo，SU Min-gang，et al.Department of Orthopedics，Baoding Municipal First Hospital，Hebei 071000，China
【Abstract】 Objective To evaluate the effectiveness of autologous bone marrow augmentation of bone formation in spinal fusion.Methods Skeletally mature Chinese white rabbits(n=24)，each weighting 3.0~3.5 kg were used for this study.A single-level posterolateral intertransverse process lumbar spine fusion was performed at L5~6.1g of corticocancellous bone graft was placed equally in the each side of intertransverse process bed.Each of the experimental animals was aspirated 2 ml of autogenous bone marrow from another iliac crest，the bone marrow was deposited on the implants.Rabbits were killed after 4，8 or 12 weeks，and the spines were excised and evaluated by manual palpation，histology，posteroanterior radiography and computed tomography for bone volume.Results In experimental group，successful spine fusion was obtained in manual palpation，radiography and histologic section.The mean volume of the fusion mass in experimental group is (807.39±373.49)mm3，while (416.66±359.55)mm3 in contral group as measured by CT.The differences were significant.Conclusion Autogenous bone marrow is a reliable and effective graft extender in the posterolateral intertransverse lumbar spine fusion in rabbits，that allows the use of less autogenous bone graft with the same end result.The method is easier to be used and its econamic outcomes is lower.
【Key words】 spinal fusion；bone marrow graft；bone graft substitutes；rabbit
脊柱融合术是脊柱外科的基本手术之一，后外侧横突间、小关节突间融合是目前常用的方法，但假关节发生率较高，据报道为20%~50％不等。自体骨髓内含有骨髓基质干细胞，具有成骨能力。本实验通过研究自体骨髓在腰椎横突间融合中诱导成骨的作用，探讨其作为骨移植添加物的效果，为临床应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组和手术 健康、骨骼成熟中国白兔24只，雌雄不限，体重3~3.5kg，随机分为实验组（14只）和对照组（10只）。腹腔内注射硫贲妥钠（30mg/kg），如麻醉效果差，加用0.5%普鲁卡因局部浸润。腰5、6棘突为中心做后正中切口，自椎旁肌外侧向前分离肌肉，显露双侧5、6腰椎横突，去除后方骨皮质，取一侧髂骨约1g修剪成约0.3cm3骨块，每侧横突间植入约0.5g。实验组从另一侧髂骨一点穿刺抽取2ml骨髓，抽吸前注射器内取0.1ml肝素钠液，2ml与髂骨块充分混匀放置数分钟，每侧融合区各植入0.5g自体髂骨和1ml自体骨髓的混合物。术后单笼喂养，未用外固定。术后4周每组各处死2只动物，8、12周，实验组和对照组每批分别处死6、4只动物。脊柱标本立即放入4℃、10％福尔马林液固定3~4天。
1.2 观察指标 （1）手工检测：8、12周标本均经手工检测确定融合率，2位有经验的医生双盲法确定。（2）X线检查：拍摄标本前后位X线片，观察融合区新生骨情况，确定融合率。（3）CT测量融合区骨块体积：标本的CT片上测量成骨体积，两组数据应用SPSS11.0统计软件分析。（4）组织学观察：完成以上检测后，所有标本切片、HE染色观察组织学变化。
2 结果
2.1 手工检测结果 实验组融合率58.3％(7/12)；对照组融合率25％(2/8)。
2.2 X线结果 显示4种结果：(1)新生骨充满两横突之间（见图1），经手工检测全部证实为牢固融合。（2）移植物全部被吸收，横突间无新生骨（见图2），经手工检测全部证实为不融合。（3）两横突之间有不同宽度的骨组织连接，图3所示的标本，手工检测证实牢固融合。(4)一侧融合，另一侧无新骨（见图4）手工检测证实为不融合。
2.3 CT测定体积的结果 见表1。表1 两组成骨数量的比较 注:P﹤0.01
2.4 组织学结果
2.4.1 实验组 4周时见大量新生骨小梁，内有较成熟骨髓组织。8周时成熟骨小梁明显增多，成骨细胞能力明显降低。成熟骨小梁表面破骨细胞数量增多，进入塑形改造阶段。12周时，新生骨小梁罕见，可见大量板层骨，表面的成骨细胞明显减少。见图5、6。
2.4.2 对照组 4周时新生骨小梁少，发育相对滞后。8周时新生、成熟骨小梁均可见到，新生骨小梁较多，成骨细胞能力弱。12周时，成熟骨小梁数量明显少于实验组。成骨细胞数目较8周时明显减少，成骨能力明显减弱。见图7、8。各时期实验组成骨方式始终以膜内成骨为主，软骨成骨为辅，对照组则相反。
3 讨论
脊柱融合术是脊柱外科的基本手术之一，后外侧横突间、小关节突间融合是目前常用的方法，但此融合区处于张力侧，同时脊柱运动时，其运动幅度较大。由于以上不利因素，假关节形成一直是其首要并发症，据报道为20%~50％不等。自体髂骨是较理想的骨移植物，具有成骨所需要的骨诱导和骨传导作用，但其来源有限，特别对于假关节形成需二次手术、需多节段融合及小儿脊柱侧弯矫形的患者。而且，取骨区并发症较多，发生率6%~25％不等。目前，有多种骨移植材料用于脊柱融合，研究较多的是具有骨诱导作用的BMP家族同各种支架或载体形成的复合物，然而其费用昂贵并可能形成异位骨化，而且某些临床实验性应用显示其效果等同于自体髂骨移植。近些年，随着同种异体骨制备、贮存、灭菌方法的提高，其抗原性和感染率逐渐降低，融合效果也日益提高［1］。但仍然存在交叉感染疾病、免疫排斥反应的风险。而且，Butterman等发现，胸腰椎后路融合应该使用自体髂骨移植［2］。目前研究较多的骨髓基质干细胞体外培养扩增后，复合载体用于脊柱融合，成骨作用强，融合率高［2］。但目前仅限于实验研究，而且对技术设备要求高，细胞培养时间较长，只能手术植入，不能经皮注射。自体骨髓内的红骨髓含有造血细胞和骨髓基质，骨髓基质中含多能干细胞，Owen［3］称之为骨髓基质干细胞，其可以在无诱导下骨化，称为确定性骨源性前体细胞（Determined Osteogenic Precursor Cells DOPC），也称为骨源性干细胞（Osteogenic Stem Cells）。Turksen K［4］等证明，DOPC体外培养逐步分化成骨源性干细胞→骨祖细胞→前成骨细胞→成骨细胞→骨细胞。 目前，国内外许多学者报道了临床应用自体骨髓移植治疗骨折延迟愈合、不愈合、骨缺损和骨囊肿，涉及到胫骨、股骨、肱骨、手舟骨等，效果较好［5~8］。本实验证实，自体骨髓在兔腰椎横突间融合模型中，是一种有效可靠的骨移植添加物，在应用较少自体髂骨的情况下，融合效果优于单纯应用自体髂骨移植，主要表现为融合时间缩短，骨量明显增加，横突间融合牢固，而且来源充足，获取方便，可以反复抽取，无传染疾病、免疫排斥反应的风险，明显减少供骨区并发症，减少患者痛苦，降低治疗费用。是有效、安全、经济的移植添加物。(本文图片见封三)
【参考文献】
1 Friedlander GE，Clayton RP，Cole DJ，et al.Osteogenic protein-1(BMP-7) in the treatment of tibial nonunions.JBJS.(Am)，2001，83:151-158.
2 Butterman GR，Glazer PA，Bradford DS.The use of bone allografts in the spine，Clin Orthop，1996，324:75.
3 Owen ME.Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system.In:Peck WA，eds.Bone and Mineral Research.Amsterdam: Elsevier，1984，1-25.
4 Turksen K，Aubin JE.Positive and negative immunoselection for enrichment of two classes of osteoprogenitor cells.J Cell Biol，1991，114:373-384.
5 梁雨田，张伯勋，卢世壁.经皮自体骨髓移植在骨缺损瘢痕组织内成骨作用的实验研究与临床应用.中国修复重建外科杂志，1999，13：148－151.6 王恒冰，王继孟，郭宗远.自体骨髓移植治疗小儿孤立性骨囊肿的初步观察.中华小儿外科杂志，2002，23：68
7 徐耀增，王晓东，董天华.自体骨髓经皮注射治疗骨延迟愈合和骨不连.中国矫形外科杂志，2003，11：584－586
8 Connolly JF，Guse R，Tiedeman J，et al.Autologous marrow injection as a substitute for operative grafting of tibal nonunious.Clin Orthop，1991，266:259-270.
作者单位：071000 河北保定，保定市第一医院骨科 (编辑：守 中)