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【摘要】 目的 探讨心房颤动心肌纤维化的发生机制。方法 杂种犬15条，随机分三组：正常对照组、单纯房颤组、房颤+Miberfradil组。采用van Gieson染色、免疫组织化学方法，结合高清晰彩色图像分析系统，观察正常对照组、单纯房颤组和房颤+Miberfradil组心房组织总胶原、Ⅲ型胶原的表达。结果 （1）单纯房颤组和房颤+Miberfradil组心房组织总胶原均明显高于正常对照组（P＜0.05）。房颤+Miberfradil组的总胶原表达明显减少，与单纯房颤组相比较，差异有显著性（P＜0.05）。（2）单纯房颤组Ⅲ型胶原的表达明显高于正常对照组（P＜0.05）。房颤+Miberfradil组Ⅲ型胶原的表达明显低于单纯房颤组（P＜0.05）。结论 持续性房颤有明显的心肌纤维化改变，T型钙通道阻滞剂能够减轻心肌纤维化的程度。
【关键词】 心房颤动；心肌纤维化；胶原纤维
The experimental study of the cardiac fibrosis during atrial fibrillation
CUI Ming-yu, GUO Lin-na, JIANG Li-ping,et al.Department of Histology and Embryology, Inner Mongolia College ,Hohhot 010059，China
【Abstract】 Objective To investigate the mechanisms of the cardiac fibrosis during atrial fibrillation. Methods Fifteen adult mongrel dogs were randomly divided into 3 group: pure atrial fibrillation group, atrial fibrillation added mibefradil group and control group. van-Gieson stain was used to detect total cardiac collagen. Cardiac collagen subtype Ⅲ were studied by immunohistochemistry and image analysis. Results （1）Total cardiac collagen was significantly increased in pure atrial fibrillation group and atrial fibrillation added mibefradil group compared with that of control group （P＜0.05） . Total cardiac collagen markedly decreased in atrial fibrillation added mibefradil group compared with that of pure atrial fibrillation group（P＜0.05）.（2） The expression of cardiac collagen subtype Ⅲ was significantly higher in pure atrial fibrillation group than that of control group （P＜0.05）. The expression of cardiac collagen subtype Ⅲ was markedly lower in atrial fibrillation added mibefradil group than that of pure atrial fibrillation group （P＜0.05）. Conclusion Cardiac fibrosis was observed during persistent atrial fibrillation and it was relieved by T-type calcium channel blocker.
【Key words】 atrial fibrillation; cardiac fibrosis; collagen fiber
心房颤动是临床常见的心律失常，并发症严重。持续性房颤可以引起心房的结构重构，表现为心肌纤维化、心肌细胞肥大，部分肌溶解现象［1］。这些改变成为房颤发生过程中兴奋传导障碍和加重功能障碍的结构基础。到目前为止，对于房颤心肌纤维化的发生机制尚不清楚。本文采用van Gieson染色、免疫组织化学方法，结合高清晰彩色图像分析系统，研究持续性房颤心房组织胶原表达的变化，探讨房颤心肌纤维化的机制，为临床治疗和防止房颤的复发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型 杂种犬15条，体重22～28kg，雌雄不拘，由中国人民解放军总医院提供。随机分三组，每组5条。分为正常对照组、单纯房颤组、房颤+Miberfradil组。房颤组均用3%的戊巴比妥钠静脉麻醉，切开右侧颈部皮肤，钝性游离右侧颈内静脉，穿刺针行颈内静脉穿刺，在X线透视下送入“J”型伞状心房单极电极，电极头固定于右耳，将电极尾端与埋藏式高频率心脏起搏器连接，起搏频率520次/min。起搏器埋置于皮下胸锁乳突肌表面的囊袋内。正常对照组不植入起搏器。房颤＋mibefradil组在术后第2天开始给mibefradil原药（瑞士罗士公司提供），按人与犬的药物剂量换算计算用药量，制成口服胶囊，每日服1次。术后观测24周。处死动物前采血，用高效液相层析法紫外光测定mibefradil的血药浓度为8.56ng/ml。
1.2 实验方法 取心肌组织标本常规甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度3μm。常规脱蜡至水。
1.2.1 总胶原纤维检测 蒸馏水洗5min，用van Gieson液染色45s,95%酒精6s,无水乙醇16s，松节油20s,封片。
1.2.2 免疫组化染色检测Ⅲ型胶原 （1）抗原修复：用枸橼酸盐缓冲液,97℃,18min，降至室温;（2）过氧化氢溶液孵育10min，水洗2min,PBS冲洗5min×2,放入湿盒;（3）血清封闭15min;（4）加入一抗，放入4℃冰箱过夜；（5）PBS洗5min×3,滴加羊抗兔二抗，室温孵育25min,PBS冲洗5min×2;（6）滴加DAB显色液2.5min;（7）苏木素复染30s,脱水透明，中性树胶封片。
1.2.3 结果判断 van Gieson液染色后，心肌纤维染成黄色，胶原染成红色，并在心肌间质中表达。结果用LeicaQWinV3高清晰彩色图像分析系统进行分析,每个标本选一张切片，每张切片随机选5个无血管视野进行统计分析，求得平均值。
免疫组化染色显示：Ⅲ型胶原阳性反应为棕黄色颗粒，在心肌间质中表达。结果用LeicaQWinV3高清晰彩色图像分析系统进行分析,统计分析中不包括血管自身胶原。每张切片任意选5个视野进行统计分析，求得平均值。
1.3 统计学处理 测量数据以x±s表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
单纯房颤组和房颤+Miberfradil组的总胶原明显高于正常对照组， 单纯房颤组总胶原又高于房颤+Miberfradil组，差异均有显著性（P＜0.05）。 Ⅲ型胶原的表达在房颤组最高，房颤＋Miberfradil组居中，正常对照组最低。单纯房颤组与房颤+Miberfradil组相比，两组间差异有显著性（P＜0.05）。图像分析结果见表1。
3 讨论
心肌纤维化是指心肌组织结构中胶原纤维过量聚集，胶原浓度明显增高或胶原容积分数显著增加［2］，它是心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌结构重构的主要表现之一。到目前为止，房颤时心肌纤维化的机制尚不完全明了。心肌Ⅰ表1 各组Ⅲ型胶原、总胶原的表达的图像分析结果 注：与正常对照组比较，*P<0.05；与单纯房颤组比较，**P<0.05
型、Ⅲ型胶原是心肌的主要间质成分，构成心肌胶原网络的支架，对心肌起支持、协调同步舒缩的作用。心肌间质胶原的变化能够反映心肌组织结构和成分的重塑。本实验研究结果显示，持续房颤6个月的单纯房颤组和房颤+Miberfradi组心肌间质总胶原及Ⅲ型胶原的表达明显高于正常对照组（P<0.05），而单纯房颤组又高于药物组（P<0.05），表明持续性房颤心肌有明显的胶原纤维增生。胶原网架的重塑增加了心房传导的不均一性，导致房内微折返环形成，使心房具有形成多个折返激动的异常基质，从而促进房颤的发生和持续［3］。有研究表明，细胞内钙超载是心房颤动和持续的主要机制，T型钙通道可能在此过程中起重要作用［4］。Miberfradi是一种新型T型钙通道阻滞剂，主要作用是阻断T型钙通道。我们的研究结果显示，房颤+Miberfradil组的总胶原及Ⅲ型胶原的表达高于正常组，但明显低于单纯房颤组。说明T型钙通道阻滞剂能够减轻心肌的纤维化，对心肌具有保护作用。减轻心肌细胞内钙超载可能减轻心肌纤维化，这也提示细胞内钙超载与心肌纤维化有关，相关机制有待进一步研究。
【参考文献】
1 Frusraci A,Chimenti C,Bellocci F,et al.Histological substrate of aterial biopsies in patients with lone atrial fibrillation. Circulation,1997,96:1180-1184.
2 张海燕.心肌胶原网络重构的研究进展.心血管病学进展，2003,24（5）：359-362.
3 何伟雄，黄从新，刘唐威，等.风湿性心脏病心房颤动患者心房细胞外信号调节蛋白与纤维的变化.中国心脏起搏与心电生理杂志，2002,16（2）：100-103.
4 Stanley N. Atrial electrophysiological remodeling caused by rapid atrial activation:underlying mechanisms and clinical relevance to atrial fibrillation .Cardiovasc Res,1999,421（2）:298-308.
作者单位：010059 内蒙古呼和浩特，内蒙古医学院组织胚胎学教研室（Δ通讯作者）