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【摘要】 目的 探讨香菇多糖（LNT）对机体的免疫系统刺激活性。方法 （1）615纯系小鼠静脉注射LNT，测定巨噬细胞吞噬功能；（2）肿瘤坏死因子（TNF）的测定；取传代后3～4天L615小鼠白血病细胞检测细胞毒；（3）荧光染色和DN A电泳观察细胞凋亡。结果 LNT能够诱导体外培养的巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞的培养上清液中TNF含量显著增加。诱导后的巨噬细胞上清对L615白血病细胞细胞毒活性由对照的11．4%增高到66．2％。且呈LNT剂量依赖性，作用后的白血病小鼠细胞体积显著缩小，核发生固缩，呈现凋亡细胞特征。结论 LNT活化后的巨噬细胞对肿瘤细胞有显著的细胞毒作用，其机制与诱导巨噬细胞产生TNF而介导肿瘤细胞凋亡有着密切的关系
【关键词】 香菇多糖 巨噬细胞 肿瘤坏死因子 细胞凋亡
Study on the mechanism of the mediated activation in mice macrophage induced by lentinan
CHEN Yuan-ning，CHEN A-mei，LIU Qing -ping.Department of Medicine,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010059，China
【Abstract】 Objective To research one of its mechanisms mediated by the activation of macrophages in murine cavity induced by lentinan （LNT） Methods （1）Observing the phagocytosis of macrophages in murine cavity induced by LNT，（2） Measuring the tumor necrosis factor （TNF）of L615 leukeamia mice after being injected by LNT,（3） Apoptosis mediated by TNF in macrophages induced by LNT. was detected with Hochest 33258 fluorochrome staining and DNA electrophoresis.Results The ratio and index of phagocytosis of macrophages in murine cavity induced by lentinan （LNT） were increased significantly.Meanwhile content of tumor necrosis factor（TNF） in supernatant of macrophages splenic cells and thymocytes induced by LNT were higher than the control.The cytoxic activation of macrophage supernatant induced by LNT on L615 leukeamia cells rose to 66.2% from the control （11.4%） and expressed a dose dependeant manner when L615 leukeamia cells were treated by the macrophage supernatant induced by LNT DNA,the apoptotic cells were found.Conclusion The macrophages activated by LNT shows high cytotoxic activation on tumor cells, and one of its mechanisms of anti-tumor cells is the apoptosis mediated by TNF in macrophages induced by LNT.
【Key words】 lentinan；macrophage；TNF;apptosis
现代研究证明，香菇多糖（LNT）可调节人体内有免疫功能的T细胞活性，可降低甲基胆蒽诱发肿瘤的能力。香菇对癌细胞有强烈的抑制作用。从细胞凋亡（Apoptosis）的角度探讨抗肿瘤途径是目前医学研究的热点。细胞凋亡机制比较复杂，而且不单纯是一个生理过程，它与很多免疫的发生发展有着重要的关系［1,2］。利用某些手段诱导肿瘤细胞凋亡进而发挥抗肿瘤目的是本课题出发点。我们利用 LNT诱导活化巨噬细胞进而介导肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤效果，更符合生物自身防御原则，达到扶正固本的作用。
1 材料与方法
1.1 巨噬细胞功能测定 615纯系小鼠（4～6周龄，中国医科院血研所动物中心）静脉注射LNT［Lentinus edodes（Berk） Sing干燥子实体中提取，福建梅峰制药厂］66.7mg/㎏体重，qd× 7d，停药第2天，腹腔注射 5％鸡红细胞（CRBC）生理盐水0.5ml／只， 8～12h后收集腹腔巨噬细胞。于载玻片上37℃温育30min，甲醇固定Giemsa－wright染液染色，油镜观察，计算吞噬百分率和吞噬指数，进行组间t检验。
1．2 肿瘤坏死因子（TNF）的测定 收集，腹腔 巨噬细胞，800g离心20min，沉淀细胞经Hank’s液（含10%的FBS）沉淀2次。用CM调细胞浓度为5×106/ml，于24孔培养孔板37℃孵育2h，洗掉未贴壁细胞加入不同浓度Lentinun培养72h收集上清液，-20℃保存。单离的胸腺细胞和脾细胞（107/ ml）于24孔板 37℃、5％CO2与lentinun（125μg／ml）作用72h后，离心收集上清，-20℃保存，取TNF标准品及各样品上清各 100μl,分别加入酶标板中，同一样品重复3～4孔，室温作用2h,洗板后加酶标，抗TNF100μl/孔，室温孵育1h，洗板，加新配制底物液100μl，室温反应至标准曲线明显时终止反应，于492nm酶标仪（DG-3022A.南京华东电子管厂）上测定结果（TNF检测kit,由北京邦定生物医药公司提供）。
1.3 观察细胞凋亡 在孵育期末，收集L615白血病细胞，弃去培养液，加入固定液（冰醋酸：甲醇为1：3）固定细胞8min，加Hoechst33258荧光染料，避光染色1h；荧光显微镜下观察细胞形态，记数100个细胞/每张玻片，计算细胞凋亡率是用凋亡细胞数占细胞总数的百分比。
D N A电泳。在孵育期末，收集L615白血病细胞，200g离心10min并悬浮于1.5 ml裂解缓冲液中。随后与100μg蛋白激酶K37℃孵育4h。酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀后再悬浮于TE缓冲液中,并用无DNA酶的 R N A酶 37℃处理 3h。DNA乙醇沉淀，最后溶解于蒸馏水中。约4μgDNA上样于1.5%琼脂糖凝胶（含溴乙啶）。
电泳完毕紫外照射拍照。
2 结果
2.1 LNT对巨噬细胞吞噬功能的影响 小鼠腹腔巨噬细胞经LNT作用后吞噬活性显著增加，吞噬百分率由对照组的12％增高到28%，与之相应的吞噬指数则由0.19上升到0．62，分别增高了2～3倍，呈极显著差异。
2.2 LNT对肿瘤坏死因子的诱导作用 小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞在无干预情况下，培养上清中TNF含量较低，分别为0.18、0.13 和0.14，组间差异无显著性。在LNT作用72h后，TNF含量显著增加，分别为0.59、0.31 和0.30。是对照组的3.3、2.4和2.0倍，差异有显著性（P<0.01），特别是巨噬细胞更为显著，是脾细胞和胸腺细胞的2倍。
2.3 巨噬细胞介导的细胞凋亡 LNT诱导的巨噬细胞上清与L615白血病细胞作用后24h，有少量的细胞发生凋亡，细胞内的染色质呈浓染的块状或颗粒状荧光出现,并聚在核周边。36h、48h随孵育时间增加凋亡细胞数量逐渐增多。
LNT诱导的巨噬细胞上清与L615白血病细胞作用后24h，DNA片段或 Ladder出现,36h、48h更为明显。作为对照组在24h、36h皆未出现DNA的 Ladder。
3 讨论
多糖的抗肿瘤作用近来已引起人们的重视［3，4］，已有的资料表明LNT具有很强的抗肿瘤活性，它对肉瘤S-180的抑制率达98.6%，而且这种高效抗瘤活性非直接作用于瘤细胞的结果。我们的研究发现LNT具有很强的活化小鼠腹腔巨噬细胞的功能，经LNT作用后的巨噬细胞其吞噬活性和吞噬指数分别增强了2.3倍和3.3倍，经活化的巨噬细胞其肿瘤坏死因子的分泌也显著增加，为对照组的3.3倍。由此提示LNT的抗肿瘤活性与活化巨噬细胞后增强TNF有着非常重要的关系，其中也证明这种内源性TNF对L615白血病细胞（同种属来源）具有高度敏感性。研究表明TNF不单纯是细胞毒作用，它可诱导成熟T细胞发生凋亡［5］。其机制与激活细胞表面Fas配体（属于TNF家员）和Fas受体有着及其密切的关系［2］。而Fas系统介导的细胞凋亡可发生于多种细胞如心肌细胞等。我们的研究发现LNT活化的巨噬细胞上清能够诱导L615白血病细胞发生细胞内的染色质聚在核周边，呈月牙状等典型的细胞凋亡特征，并且LNT活化的巨噬细胞上清能够诱导L615白血病细胞发生DNA“阶梯”状电泳带等典型的细胞凋亡特征。因此巨噬细胞介导的抗肿瘤细胞活性与其产生TNF诱导的肿瘤细胞凋亡密切相关。细胞毒活性与细胞凋亡可能是同一抗肿瘤过程中不同时相及其不同活性状态时（即TNF含量、活性状态及作用时间）所表现出的抗肿瘤细胞的不同生物学效应。
【参考文献】
1 Li J,Guo WJ, Yang QY. Effects of ursolic acid and oleanolic acid on human colon carcinoma cell line HCT15.World J Gastroenterol,2002，8（3）:493-495.
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3 Ladanyi.Effect of lentinan on macrophage cytotoxic against metastatic tumor cell. Cancer Immunol Immunother，1993，36:123.
4 吴雄志，陈丹，艾青，等.多糖抗肿瘤机理研究进展.中国中医基础杂志，2001,7（12）：67.
5 Zheng LI ,Fisher G, Miller DE,et al.Induction of apoptosis in mature T cells by tumor necrosis factor.Nature，1995，377（28） : 995.
作者单位：010059 内蒙古呼和浩特，内蒙古医学院附属医院内药房