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【摘要】 目的 研究电击死兔心脏窦房结组织中纤维连接蛋白的表达。方法 应用SP免疫组化法对实验组与对照组进行免疫组化研究，同时应用常规染色作比较。结果 电击死12h窦房结内细胞表达纤维连接蛋白（Fn）呈强阳性，与对照组呈弱阳性表达差异有显著性（P<0.05）。结论 窦房结组织中纤维连接蛋白的强阳性表达对电击死的法医学鉴定有一定参考价值。
【关键词】 法医病理学;电击死;纤维连接蛋白; 窦房结;免疫组化
The expression of fibronectin in heart sino-atrial node tissue of died rabbit due to shock
LIU De-bin, MA Ke-wei, LI Cheng, et al.The People’s Procurator of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010011，China
【Abstract】 Objective To study the expression of fibronectin in sino-atrial node tissue of died rabbits due to shock.Methods SP immunohistochemical study was used in the experimental group and control group and the application of conventional staining was used for comparison.Results Sino-atrial node cells with the expression of fibronectin （Fn） was strongly positive in electric shocks to die of 12h, with a significantly difference as compared with the control group （P<0.05）.Conclusion It is a certain reference value to rorensic identification that fibronectin has expressed the strong positive in sinus node.
【Key words】 forensic pathology; electric shock; fibronectin; sino-atrial node; immunohistochemistry
目前，电击死的法医学鉴定，主要集中于电击局部的组织改变,并通常以电击部位的特征性损伤（如:电流斑、皮肤金属化等）作为鉴定依据。但统计显示,在220V电压所致电击伤（死）中只有1/3的案例出现典型的皮肤电流斑,故实用范围有限。国内许多学者尝试从不同的角度,寻找电损伤的鉴定依据,如竞花兰等［1］，对电击局部的血管、神经、肌肉进行的研究;张鹏等［2］对电击死心脏从病理学改变角度提供的形态方面的探讨等。心脏传导系统疾病常是全身或心脏病变的一部分,也可以是独立的发生。心脏传导系统疾病虽不多见,但它可诱发心律失常导致猝死。心源性猝死是法医学中的重要组成部分,故法医应该了解、掌握心脏传导系统病变,以便在损伤与疾病并存中作出准确鉴定,为执法部门提供量刑定罪的依据。本文笔者对电击死心脏传导系统窦房结的纤维连接蛋白（Fibronectin，Fn）的表达进行研究，以期为电击死的诊断提供新的理论依据,同时更大范围地扩大该指标的实际法医学应用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 Fn免疫组织化学S-P试剂盒（博士德）与DAB显色剂（北京中杉生物技术公司）（即用型）。
1.2 实验动物 健康成年长耳大白兔，雌雄不限。体重平均 2.5～3.0kg左右,由中山大学动物实验中心提供。
1.3 动物模型建立 建模的方法分别是:（1）阴性对照组采用空气注射处死;（2）电击是在220V交流电源的两端各接一金属夹,把金属夹分别直接夹住兔左后肢和右前肢近踝关节仅有少量细毛的地方。电击死组直接电死。模型建立后分别在相应的时间采用宋一璇等［3］建立的取材方法取窦房结及其周围组织。将所取组织置于4%的中性甲醛溶液固定，24h后用石蜡包埋、切片,分别进行HE和免疫组织化学染色,然后进行分析。行连续切片,每一切面取5张切片,用SP免疫组化法检测Fn表达。
1.4 实验分组 将兔随机分成两大组:阴性对照组和实验组。阴性对照组又按照处死后取材时间的不同分为7个组（0、1、3、6、12、24、48h）,其主要为死后的情况做对照。实验组又分为7个电击死组（0、1、3、6、12、24、48h）。
1.5 HE染色 采用常规方法染色。
1.6 免疫组织化学 按照试剂盒说明书进行, 以PBS代替一抗做空白对照。
1.7 结果判定及图像分析 免疫组化阳性反应为细胞内有棕黄褐色颗粒沉积。在100倍光镜下找到阳性反应区域,再在400倍光镜下观察阳性反应情况,每个部位的阳性反应区域随机选取6个视野用Biomias图像分析仪对其染色强度进行分析,结果用灰度值表示。灰度值为0～260,代表阳性反应强度,灰度值越高,阳性反应越强。
1.8 统计学分析 检测数据分析用x±s表示。统计学处理用SPAS12.0软件进行t检验,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 HE染色结果
2.1.1 正常对照组 实质细胞位于纤维组织形成的网架中,从中心区向周边区排列逐渐整齐,渐趋于平行。P细胞,又称起搏细胞（pacemaker cell）, 多位于结的中央区和窦房结动脉的周围,头部较多,也可见于外周带,可见细胞成团,成状分布。P细胞小而短,HE染色P细胞纵切呈短梭形、圆柱形或短杆形,略有弯曲,斜切为椭圆形,横切呈圆形。胞质淡染,横纹不清楚,胞核呈短棒状或卵圆形,位于细胞中央,核横径几乎与细胞直径相等（见图1-1；图1-2）。
2.1.2 电击组 造模后电击组的起搏细胞 （P细胞 ）边界不清,胞核染色加深,胞浆嗜酸性增强,伊红染色松散,部分P细胞肿胀明显 ,部分胞质可见空泡及散在的细胞核固缩 （见图1-3） 。
2.2 Fn免疫组化结果 窦房结中观察的纤维连接蛋白（Fn）阳性染色为棕黄色,分布于细胞质及细胞膜上,横切面上阳性颗粒为较均质地散在分布。纵切面上阳性颗粒非均质分布,多与细胞长轴平行。阴性对照为无棕黄色着色。正常对照组，阳性表达范围与点击组一致，但染色明显呈弱表达。电击组在电击后即刻就可见表达增加,12h达到高峰,随后逐渐下降,第24h其值仍高于对照组（见表1），而48h表达下降。阴性对照组则未见类似改变。（见图2-1、2-2、2-3，表1）。 表1 兔电击死不同时间窦房结细胞纤维连接 蛋白（Fn）的免疫组化表达灰度值 注：表中* 表示电击死组各值与同时间段对照组比较，P<0.05；表中# 表示电击死组各值与上一组比较，P<0.05
3 讨论
窦房结（sinoatrial node,SAN）是心脏正常起搏点,其结构机能状态对维持心脏正常节律,保证心房、心室收缩和舒张频率具有重要影响。SAN中神经的分布、增龄性变化以及病理学改变，将有助于阐明SAN的生理机能及其病理学改变与猝死的关系。电击死是法医实践工作中常遇的案例,但其致死机制尚不清楚,且诊断有一定的困难,故目前展开的研究都在企图寻找最可靠的诊断方法。皮肤电流斑、金属化是法医工作者诊断电击伤和电击死的主要依据,但并不是所有的案例都会出现这些典型的电击标志。大量研究表明心脏在受到电击,特别是致死性电击后会出现一系列明显的病理生理改变。心脏的缝隙连接（gap junction,GJ）功能主要是完成心脏细胞之间的电化学信息交换［4～6］。而心脏的GJ通道正是实现传导细胞间电耦联的结构基础。不同部位连接蛋白表达和分布情况与心脏不同部位电传导功能及心脏生理、病理传导有关,从而对深入了解正常成人心传导系不同部位连接蛋白的表达分布情况提出了要求。目前电击死窦房结不同部位间表达纤维连接蛋白（Fn）报道很少故深入研究心脏电击死的病理变化,不仅有助于揭示其发生机制,更有助于评判其在法医学领域中的应用价值。本实验造模后电击组的起搏细胞 （P细胞）边界不清,胞核染色加深,胞浆嗜酸性增强,伊红染色松散,部分P细胞肿胀明显,部分胞质可见空泡及散在的细胞核固缩;电击组Fn有较强的阳性表达，就本实验的研究结果来看,应该是当电流在机体形成通路时,电流形成电场,但这个电场的作用只是使带电大分子的极性发生了改变,结构发生了重排,从而使带电的离子如钠离子、钾离子的活动发生了改变,最后导致了窦房结细胞的一系列改变。至于电击后窦房结细胞胞浆中Fn表达的变化,应该是电流作用在短时间内使正常心肌细胞内的生理变化发生了微妙的改变,从而导致了细胞胞浆内Fn表达的增加。由上可见, Fn可用于对电击死诊断的一个辅助指标。（本文图片见封三）
【参考文献】
1 竞花兰,姜富学,成建定.大鼠电击死心脑肺及皮肤超微结构的改变.中国法医学杂志, 2004, 19（6）: 344-346.
2 张鹏,袁世俊.电击死心脏病理学研究.中国法医学杂志, 1994, 10 （2）: 57.
3 宋一璇,祝家镇.改良的心脏传导系统检查法.中国法医学杂志,1997,12（1）:31-33.
4 Evans WH,De Vuyst E,Leybaert L.The gap junction cellularinternet: connexin hemichannels enter the signalling limelight.Biochem J,2006,397（1）:1-14.
5 Severs NJ,Dupont E,Thomas N,et al.Alterations in cardiac connexin expression in cardiomyopathies.Adv Cardiol,2006, 42:228-242.
6 Lin H,Oqawa K,Imanaqa I,et al.Alterations of connexin 43 in the diabetic rat heart.Adv Cardiol,2006,42:243-254.
7 Lampe PD,Lau AF.The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communication.Int Biochem Cell Biol,2004, 36（7）:1171-1186.
作者单位：1 010011 内蒙古呼和浩特，内蒙古自治区人民检察院技术处2 010017 内蒙古呼和浩特，内蒙古自治区医院泌尿外科3 010023 内蒙古呼和浩特，内蒙古武警总队医院4 010059 内蒙古呼和浩特，内蒙古医学院基础医学院（△通讯作者）