噬菌体裂解法快速培养鉴定结核分支杆菌

　　【摘要】 目的  探讨噬菌体法进行结核杆菌快速培养的特异性及敏感性以及该方法与传统方法的同源性。 方法  应用噬菌体法进行结核分支杆菌、牛分支杆菌以及非结核分支杆菌的培养;同时应用噬菌体法与传统的罗氏培养法进行结核菌培养及药敏测定。 结果  该方法检出最低浓度为103CFU/ml，特异性达到100%，药敏实验同传统方法的符合率为83.3%，临床涂阳培阳标本18例，本法阳性16例，检出率为88.8%，涂阴培阳标本15例，本法阳性8例，检出率为53.5%，涂阴培阴标本17例，本法阳性4例，检出率为23.5%。 结论  噬菌体裂解法具有很高的敏感性和特异性，同时与传统方法比较具有较高的药敏符合率。
       
    
　　现在大部分地区肺结核患者的诊断是依靠实验室诊断、临床症状和体征，而实验室诊断最主要是依靠从有症状的初次就诊病人的痰液标本进行常规的涂片显微镜检查，痰液涂片显微镜检查将筛选大部分的结核感染病例。然而，众所周知，这种检查方法将漏诊很多的结核感染病人，这些漏诊的病人就是感染源。经过消化处理或去污染处理的痰标本结核杆菌培养方法是诊断肺结核的较为敏感的方法，然而这种方法需要耗费几周的时间，从而不能及时诊断肺结核，导致结核病的传播。因而结核病细菌学快速检查历来是国内外学者所关注的热门课题 ［1，2］ 。
   
　　目前耐药、流动人口、HIV感染已经成为当今结核病控制所面临的三大难题。其中耐药性是我国结核病起主要限制性作用的因素。因而结核菌的培养和药敏结果在结核病的防治中起着重要作用。
   
　　我们通过噬菌体裂解法对结核分支杆菌及非分支杆菌进行了快速培养与鉴定，同时进行了药物敏感性测定，并与传统的罗氏培养法进行了比较。现报告如下。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料 结核分支杆菌快速诊断试剂盒（Fast plaque TB  TM ）由北京华诚沛丰生物技术有限公司提供。结核分支杆菌、牛分支杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌来自吉林市结核病防治研究所临床菌株。结核病患者痰标本50份，其中涂阳培阳标本18份，涂阴培阳标本15份，涂阴培阴标本17份。
   
　　1.2 方法 按试剂说明书操作，主要步骤如下。
   
　　1.2.1 标本前处理 临床标本用NALC—NAOH去污染，用15ml PhageTek MB Medi Plus冲洗，37℃过夜。（菌液不用去污染，药敏试验加入相应药物，S、R孵育24h，H孵育48h，终浓度分别为S1μg/ml、R2μg/ml、H0.1μg/ml）。
   
　　1.2.2 感染噬菌体 向标本中加100μl噬菌体（Actiphage），37℃孵育1h。
   
　　1.2.3 杀死TB体外游离的噬菌体:向标本中加100μl强效病毒剂（Virusol），充分震荡，静置5min。
    
　　1.2.4 中和 向标本中加5ml Medium plus，静置片刻。
   
　　1.2.5 表达 向标本中加1ml帮助细胞（Helper cell），倒入瓶皿中，加入5ml融化的琼胶（不易过热50℃～60℃），迅速旋转混匀，静置，37℃过夜。
   
　　1.2.6 结果判定 0～19个菌斑表明阴性结果，说明标本中无活着的结核杆菌;20或更多菌斑表明阳性结果，说明标本中有活着的结核杆菌。（药敏结果的判定:药敏培养基菌斑数小于20或药敏培养基菌斑数/对照培养基菌斑数小于10%，判定为敏感;药敏培养基菌斑数/对照培养基菌斑数大于50%，判定为耐药;介于10%～50%之间判定为可疑）。

　　2 结果
    
　　2.1 应用10例结核分枝杆菌分别在10 2 、10 3 、10 4 、10 5 、10 7 CFU/ml浓度，（Mcfarland3.0浊度相当于细菌浓度107CFU/ml）进行噬菌体法检测结核菌。该方法检出最低浓度为103CFU/ml。详见表1。
    
　　表1 噬菌体法检测不同浓度结核菌的结果（略）
   
　　2.2 噬菌体法结核菌培养的特异性实验 铜绿假单胞菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌4种呼吸道常见细菌各10株应用噬菌体法检测均为阴性。牛分支杆菌、结核分支杆菌各10株，进行噬菌体法结核菌检测均为阳性。（菌液浓度均为10 5 CFU/ml）其特异性达到100%。
   
　　2.3 噬菌体法进行药物耐药性分析，噬菌体法药敏实验同传统方法的符合率为83.3%，分别为S90%、R90%、H70%。详见表2。
   
　　2.4 肺结核患者临床痰标本50株，直接进行噬菌体法结核菌检测。涂阳培阳标本检出率为88.8%，涂阴培阳标本检出率为53.3%，涂阴培阴标本检出率为23.5%，详见表3。

　　表2 噬菌体法与传统罗氏法两种方法药敏实验的比较（略）
    
　　注:敏感“-”，耐药“+”，罗氏法低浓度耐药高浓度敏感“+-”;噬菌体法菌液浓度均为10 4 CFU/ml;噬菌体法可疑“?”

　　表3 50例肺结核患者临床痰标本的噬菌体法检测结果（略）
    
　　3 讨论
    
　　分支杆菌噬菌体在1947年由Gardner首次分离并命名，之后，不同种分支杆菌噬菌体陆续被分离，至今已分离出250余种 ［3］ 。随着人类对噬菌体结构和功能的不断认识，噬菌体作为一种研究工具的功能正逐步被开发，一些相关机制如L5、D29的全基因序列已逐步被阐明 ［4］。近20年来，分支杆菌噬菌体广泛用于DNA重组技术中，并已在分支杆菌快速鉴定及药物敏感性试验中得以广泛应用 ［5，6］ 。北京华诚沛丰生物技术有限公司提供的FAST Plauqe TB是一种用噬菌体方法检测待检标本中是否存在活的结核分支杆菌的检测方法。该方法的基本原理是分支杆菌噬菌体只能感染相应的活的分支杆菌，如待检标本中无相应的分支杆菌，则噬菌体被随后加入的杀毒剂全部杀死，因而后加入的提示细胞未受噬菌体感染，只能在培养皿中生长繁殖，无噬菌斑出现 ［7］ 。但如待检标本中有相应的分支杆菌，则噬菌体侵入菌体内，免遭杀毒剂破坏，并在菌体内大量增殖，最终裂解菌体，释放出来的噬菌体即可感染指示细胞，并使指示细胞裂解出现噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无，即可确定待检标本中是否含有相应的活的分支杆菌。
   
　　本研究结果表明，菌液浓度达到10 3 CFU/ml就能检测出来（涂片检出浓度为10 4 CFU/ml），因此具有较高的灵敏度。特异性试验结果表明只有结核分支杆菌才出现阳性结果，而4种呼吸道常见菌检测结果均为阴性，说明特异性达到100%。药敏实验结果表明本法与传统罗氏培养法的药敏符合率达到83.3%，说明二者之间具有较好的同源性。临床标本检验结果表明，涂阳培阳标本检出率为88.8%，涂阴培阳标本检出率为53.3%，涂阴培阴标本检出率为23.5%，平均检出率达到56.0%，大大高于涂片30%的检出率。而报告时间（2～4天）明显低于传统方法培养所需要的时间（2～3个月）。由上述研究结果可看出，本法快速、简便，同时具有很高的敏感性和特异性，是一种较理想、有发展前途、对结核病有诊断及治疗意义的新方法。同时，由于噬菌体的裂解作用，实验过程中能将结核分支杆菌杀死，对实验操作人员有保护作用，而且无须特殊仪器，成本低廉，易于我国实验室推广 ［8，9］ 。
    
　　参考文献
    
　　1 唐神结，肖和平.分支杆菌快速分离培养技术研究进展.中华结核和呼吸杂志，2000，23:762-764.
   
　　2 Badak ZF，Kiska DL，Setterquist S，et al.Comparison of mycobacteria growth indicator tube with BACTEC460for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens.J Clin Microbiol，1996，34:2236-2239.
   
　　3 McNemey R.TB:the return of the phage.A review of fifty years of my-cobacterrphage research.Int J Tuberc Lung Dis，1999，3:179-184.

　　4 Ford ME，Sarkis GJ，Belanger AE，et al.Genome structure of mycobacte-riophage D29:implications for phage evolution.J Mol Biol，1998，279:143-164.
   
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　　7 Wren BW，Stabler RA，Das SS，et al.Characterization of a haemolysin from Mycobacterium tuberculosis with homology to a virulence factor of Serpulina hyodysenteriae.Microbiol，1998，144:1205-1211.
   
　　8 Elteringham IJ，Wilson SM，Drobniewski FA.Evaluation of a bacterio-phage-based assay（phage amplified biologically assay）as a rapid screen for resistance to isoniazid，ethambutol，streptomycin，pyrazi-namide，and ciprofloxacin among clinical isolates of Mycobacterium tu-berculosis.J Clin Microbiol，1999，37:3528-3532.
   
　　9 McNerney RP，Kiepiela KS，Bishop PM，et al.Rapid screening of My-cobacterium tuberculosis for susceptibility to rifampicin and strepto-mycin.Int J Tuberc Lung Dis，2000，4:1-7. 

　　作者单位:400000重庆第三军医大学西南医院（现工作单位武警吉林总队医院）
   
　　　　　　　130052吉林长春武警吉林省总队医院检验科
   
　　　　　　　130211吉林省吉林市结核病防治研究所