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1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性BALB/c小鼠,6~8周龄,体重18~20g,军事医学科学院实验动物中心提供,常规条件饲养,自由饮水进食,实验前禁食12h [2] 。
1.2 主要试剂 ConA(concanavalin A,刀豆球蛋白A)为美国Sigma公司产品;NO检测试剂盒购于北京邦定泰克生物技术公司;TBA(2-thiobarbituric acid,硫代巴比妥酸)为德国Merck公司产品;SDS(sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸钠)、TEP(tetraethoxy propane,四乙氧基丙烷)均为瑞士Fluka公司产品;余试剂均购于北京化学试剂公司。
1.3 实验方法及检测项目
1.3.1 动物分组及处理 [2] 56只小鼠随机分成两组,每组28只。所给剂量ConA:20mg/kg,生理盐水溶解。对照组动物给予生理盐水0.2ml尾静脉注射。试验组动物一次性给予ConA生理盐水溶液0.2ml尾静脉注射;两组动物在处理结束后3h、6h、9h和12h4个时间点分别取7只动物眼眶采血,分离血清;取血后拉颈处死动物,打开腹腔,摘取肝脏右叶,准确称量500mg肝组织,以生理盐水为介质在冰浴中制成肝匀浆。
1.3.2 血清ALT、AST测定 日立7020全自动生化分析仪测定。
1.3.3 血清NO主要代谢产物NO 2- 浓度测定 按试剂盒说明书进行。
1.3.4 肝组织脂质过氧化主要产物丙二醛(MDA)的测定 [3] 取10%肝匀浆0.2ml,加入8.1%SDS0.2ml,振摇,再依次加入20%乙酸(pH3.5)1.5ml,1%TBA1.5ml,蒸馏水1.0ml,摇匀加塞后95℃水浴60min,冷却后3000rpm离心15min,取上清液在紫外分光光度计上532nm处测吸光度。以TEP为标准品制作标准曲线,计算出MDA含量。
1.4 统计分析 计量数据用均值±标准差(X±s)表示,行方差分析得出X 2 值、P值。
2 结果
2.1 一般情况 试验组动物在不同时间点出现不同程度的变化,包括活动减少、精神萎靡、毛发竖立及嗜睡等;而对照组动物活动基本正常,精神状态良好。
2.2 血清ALT、AST含量的变化 试验组ALT、AST呈进行性升高尤其是在中后期急剧升高,在12h分别高达1222.96±168.35U/L和1345.57±389.65U/L,反映了肝组织细胞受损程度严重(表1),与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01)。但对照组血清ALT、AST变化不明显。
表1 两组动物血清ALT、AST含量变化 (略)
注:与对照组比较, ˇ P<0.05, ˇˇ P<0.01;与同组3h比较, ▲ P<0.05;与同组3h、6h比较, ★ P<0.05, △ P<0.01
2.3 血清NO 2- 浓度的变化 对照组血清NO 2- 浓度随时间变化不大,而试验组血清NO 2- 浓度随时间不断升高。在12h时高达255.19±70.72μmol/L,与对照组比较差异有非 常显著性(P<0.01),且与同组3h、6h比较P<0.01。结果表明在试验组动物体内NO的合成逐渐增多(表2)。
表2 两组动物血清NO 2- 含量的变化(略)
注:与对照组比较, ˇ P<0.05, ˇˇ P<0.01;与同组3h、6h比较, △ P<0.05。
2.4 肝组织匀浆MDA含量的变化 对照组肝组织MDA含量的整个过程中变化不大;而试验组MDA含量随时间呈明显上升趋势,暗示了在试验组动物肝脏内发生了逐步加重的脂质过氧化反应。尤其在12h时与对照组比较P<0.01(表3)。
表3 两组动物肝组织MDA含量变化(略)
注:与对照组比较, ˇ P<0.05, ˇˇ P<0.01;与同组3h比较, △ P<0.05, ˇˇ P<0.01;与同组6h比较, △ P<0.05
3 讨论
ConA是一种被广泛应用的可活化T淋巴细胞的丝裂原,其诱发的BALB/c小鼠肝损伤在形态学的明显表现是肝细胞的凋亡与坏死,且肝功能血清指标ALT、AST急剧升高,其病理组织学的改变及肝功生化指标的变化与人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等病理生理变化十分相似 [2] ,但其所致肝损伤的确切机制仍不十分清楚 [4] 。我们在应用ConA诱发BALB/c小鼠肝损伤实验动物模型的实验中,分别于3h、6h、9h和12h4个时间点进行相关指标的观察,来探讨在ConA诱导肝损伤部分机制中NO、LP的作用。在试验组给予ConA后3h血清ALT、AST即可轻度升高,随后均急剧上升,在12h时与对照组比较差异有非常显著性,表明试验组动物肝脏发生的炎症程度逐步增强,肝实质细胞的损害不断加重。 我们发现,试验组动物血清NO代谢产物NO 2- 的浓度随时间的延长呈上升趋势,至12h时与对照组比较P<0.01,表明小鼠体内NO生物合成机制被激活,且血清NO 2- 与ALT、AST之间呈平行升高关系。NO是一种广泛生物学效应的小分子化合物,其作为一种新型的细胞信使分子、自由基和细胞毒性因子,高水平的NO对细胞的功能产生多方面的重要影响 [6,7] 。NO作用于细胞膜与线粒体膜造成膜结构的破坏和功能的紊乱,导致细胞死亡;作用于细胞DNA,使DNA单链或双链断裂、交链,DNA碱基缺失与错配,致使细胞坏死、凋亡;另外还可以干扰细胞能量代谢、通过cGMP/非cGMP依赖方式作用于细胞凋亡基因,启动凋亡程序,诱导细胞凋亡。由实验结果可推断NO参与了ConA性肝损伤,可能通过上述途径诱导了肝细胞的坏死与凋亡。脂质过氧化是指自由基和不饱和脂肪酸氧化分解成各种产物的复杂过程,在脂质过氧化反应过程中,不饱和脂肪酸氧化分解放出主要终产物丙二醛(MDA)等具有很强的毒性作用,可与蛋白质形成醛-蛋白加合物,通过一系列的作用而导致组织细胞的损害,目前认为其主要的作用方式有 [8] :(1)直接抑制酶的活性,MDA能与细胞色素氧化酶C的赖氨酸残基形成加合物或进行修饰,影响线粒体呼吸链的电子传递,还可导致DNA的损伤;(2)脂质过氧化反应能使GSH含量降低,使机体肝脏的解毒能力下降,增加了肝细胞对损伤因子的敏感性,使细胞膜结构易受破坏;(3)脂质过氧化反应还可以导致生物膜的完整性破坏,使细胞内Ca 2+ 稳态失调,致细胞膜磷脂水解,并耗竭ATP及引起DNA的断裂,最终导致细胞的死亡。我们研究发现试验组肝组织MDA的含量不断上升,提示在肝组织内脂质过氧化反应不断加剧。而NO本身即是一种自由基,亦可诱发脂质过氧化反应导致肝组织细胞的损伤,结合血清NO主要代谢产物NO 2- 的浓度变化,我们认为,NO可能进一步加重了ConA所致肝损伤中的脂质过氧化反应,从而表明脂质过氧化也是ConA诱发小鼠肝损伤的重要机制之一。
综上所述,本研究初步揭示了在ConA诱发BALB/c小鼠肝损伤过程中存在NO生物合成机制的激活及脂质过氧化反应的发生,表明NO、LP可能在人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等病理改变过程中发挥了很重要的作用,这为人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等发病机制的进一步研究、为临床寻找有效的预防与治疗手段提供重要的实验依据。
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作者单位:100039北京解放军第302医院
100850北京军事医学科学院