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关键词 树突状细胞 基因转染 表型 脐血 低温冻存
The expression of CD86and CD83on EBV-LMP2dendritic cells vaccine derived from cord blood after cryopreservation
Huang Yangliang，Mo Xuelian，Li Jie，et al.
2000Grade Experimental Class Research Group，Shantou University Medical College，Shantou515041.
【Abstract】 Objective To prepare human cord blood derived，cryopreserved dendrtic cells（DC）vaccine by thansfected with EBV-LMP2and study its morphology and phenotype.Methods CD34 + cells were purified from cord blood with CD34 + stem cell kit by mini MACS.The cells were induced into DC under the stimulation of GM-CSF and TNF-αfor14days and then cryopreserved in liquid nitrogen.EBV-LMP2-DC vaccine was prepared by transfected cryopreserved DC with recombined EBV-LMP2adenovirus.The morphology of DC vaccine was observed dynamically under the phase contrast microscope and the expression of CD86and CD83was detected with FACS.Reˉsults During the proliferation and differentiation，the cell number increased and formation cell clusters，sometime the cells come into irregular and with dendrites，with typical morphology of mature DC.After cryopreserved in liquid niˉtrogen，more than85%alived cells were recovered.The EBV-LMP2-DC maintained the typical shape of mature DC.The results of FACS manifested that the expression of CD86and CD83were71.69%and61.17%respectively.Conclusion EBV-LMP2-DC prepared by transfecting cryopreserved DC with EBV-LMP2can sustain the morˉphology and phenotype of mature DC，which offers the experimental material for the further study of EBV-LMP2-DC in clinical therapy of nasopharyngeal carcinoma.
Key words dendritic cell gene transfection phenotype cord blood cryopreservation
树突状细胞（dendritic cell，DC）疫苗抗肿瘤的基础和临床研究已有大量报道，在肿瘤临床治疗试用中也取得一定疗效 ［1，2］ 。我们曾报道应用来源于人脐血CD34 + 干细胞DC疫苗的抗肿瘤效应 ［3］ 。潜伏膜蛋白2（LMP2）是EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）在鼻咽癌中表达的一种蛋白，能诱发特异性CTL活性。为保存足够量、同批次的人脐血DC，又使LMP2能在DC内持续表达，本研究在成功扩增人脐血来源DC的基础上，低温冻存后制备冻融的EBV-LMP2-DC疫苗，并观察分析疫苗的形态及表型，为进一步诱导针对LMP2特异性靶向CTL活性的抗肿瘤研究提供理想的疫苗。
1 材料与方法
1.1 人脐血来源 新鲜健康人脐血由汕头大学医学院第一附属医院妇产科提供。
1.2 主要试剂 Mini MACS磁式细胞分选器和CD34 + 干细胞分选试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司。细胞因子rhGM-CSF和rhTNF-α为英国PEPRO TECH ECLTD公司产品。FITC标记CD83、CD86抗体购自CALBIOCHEM公司。Ficoll-hypaque（d=1.077）分离液购自天津血液研究所。Ad-LMP2（Adeasy-LMP2重组腺病毒，包含EBV-LMP2基因）由中国疾病预防控制中心病毒所惠赠。
1.3 人脐血CD34 + 干细胞的分离及DC的扩增培养与冻存 无菌采集健康产妇脐静脉血，20U/ml肝素钠抗凝（4℃保存时间<4h），Ficoll-hypaque密度梯度离心收集单个核细胞，应用CD34 + 干细胞分选试剂盒和免疫磁珠标记法，经Mini MACS磁式细胞分选器分离出CD34 + 干细胞;再用含10%新生牛血清（NCS），100μg/mlrhGM-CSF，50U/ml rhTNF-α的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO 2 、饱湿条件下扩增培养，隔日半保留换液，培养14天，其间于倒置显微镜下动态观察DC的形态变化。收集DC，计数后常规冻存于液氮2周。
1.4 EBV-LMP2-DC疫苗的制备 常规复苏细胞并计数，复苏细胞回收率>85%。洗涤后用RPMI1640重悬DC，加入MOI为200的Ad-LMP2，混匀，37℃孵育2h，离心洗涤，再用含10%NCS、100μg/ml rhGM-CSF，50U/ml rhTNF-α的RPMI1640培养液继续培养48h，收集的细胞即为EBV-LMP2-DC疫苗。
1.5 流式细胞仪检测细胞表型 应用直接免疫荧光法检测EBV-LMP2-DC疫苗的表型。用PBS调EBV-LMP2- DC疫苗的细胞浓度为1×10 6 /ml，按每管150μl加入离心管，再加入FITC荧光标记的单克隆抗体CD86、CD83每管20μl;设FITC荧光标记的IgG为对照管。置4℃避光过夜，PBS洗涤2次，上流式细胞仪检测DC表型。
2 结果
2.1 活细胞动态观察 经Mini MACS磁式分选的脐血CD34 + 干细胞小而圆，收获率为0.5%～1%，台盼蓝排斥试验98%以上呈阴性的活细胞。细胞因子GM-CSF和TNF-α诱导培养14天，细胞数量扩增10～20倍。其间细胞体积逐渐增大，细胞形态变得不规则，并形成细胞集落;随着集落增大，集落边缘出现毛刺状突起，集落周围的成熟DC逐渐脱落。脱落DC悬浮生长，为大小不等，形态极不规则，突起迥异的成熟DC。冻存复温后存活的DC以及EBV-LMP2-DC疫苗仍保持原有的成熟DC形态。
2.2 EBV-LMP2-DC疫苗的表型分析 流式细胞仪检测结果表明，EBV-LMP2-DC疫苗的CD86表达率为71.69%，CD83表达率为61.17%（图1、2）。图1 EBV-LMP2-DC的CD86和CD83表达的流式细胞仪散点图图2 EBV-LMP2-DC的CD86和CD83表达的流式细胞仪分析3 讨论DC是人体内最强大的抗原提呈细胞，在肿瘤免疫中起着举足轻重的作用。近年来，以DC为基础的肿瘤免疫治疗研究，特别是在如何提高肿瘤细胞的免疫原性、促使DC更有效地提呈肿瘤抗原和激发宿主CTL活性方面有长足的进展。如应用各种形式的肿瘤抗原、人工合成的肿瘤抗原肽、肿瘤特异性抗体等，先于体外冲击致敏DC，再以各种途径回输体内，诱导机体产生抗肿瘤CTL活性;或以肿瘤细胞与DC直接融合制备的瘤苗，或将肿瘤抗原基因导入DC制备疫苗，回输体内同样能诱导抗肿瘤CTL活性 ［4～6］ 。此回输疗法在国外已试用于多种肿瘤的临床治疗，均取得一 定疗效。本实验研究选用人脐血，是因其来源广泛、费用低廉、供需双方均无痛苦，还有组织相容性好、可供选择的余地较大等特点;又因CD34 + 干细胞是DC的主要前体细胞，人脐血CD34 + 干细胞易于分离纯化，加入GM-CSF和TNF-α后能诱导扩增出大量成熟DC ［7，8］ 。因此，人脐血可作为DC的来源，特别对于某些存在DC功能缺陷的晚期肿瘤患者而言，更是DC的理想来源。
选用冻存复温的DC，是由于DC疫苗的临床治疗一般采用分次输入法，因此保存足够量、同批次人脐血DC，备以分次取用，是理想的方法。实验结果显示冻存复温后的人脐血DC与新鲜培养扩增DC的形态无明显差异，表明冻存复温后的人脐血DC仍保持成熟DC的形态。
鼻咽癌是广东省高发的恶性肿瘤之一，目前最好的治疗方法是放疗，但对晚期患者的疗效仍较低。一旦发生肿瘤转移，病死率也较高。EB病毒在鼻咽癌的病因学中有着十分重要的作用，EB病毒在鼻咽癌中表达多种蛋白，其中LMP2可诱发较强的特异性CTL反应 ［9］ 。本研究采用包含EBV-LMP2基因的重组腺病毒Ad-LMP2感染DC制备EBV-LMP2-DC疫苗，是选择与肿瘤病因相关的病毒抗原基因，替代目前未知的肿瘤特异性抗原基因导入DC，使之在DC内持续表达，以靶向治疗肿瘤 ［10］ 。流式细胞术检测选用CD86和CD83，前者是成熟DC的相对特异性标志，后者是DC功能成熟的相对特异性标志 ［11］ ，结果表明，低温冻存复温后制备的EBV-LMP2-DC疫苗，不仅保持成熟DC的形态，而且表达CD86，也表达CD83，表明低温冻存复温后制备的EBV-LMP2-DC疫苗可为鼻咽癌防治的进一步基础和临床研究提供理想的疫苗和实验依据。
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ˇ 基金项目:国家863资助项目（批号:2001AA217091）
作者单位:515041广东省汕头市汕头大学医学院2000级实验班科研组
515041广东省汕头市汕头大学医学院第二附属医院
515041广东省汕头市汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室（指导教师）