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Chen Xing，Yu Jiyun，Xiu Bingshui，et al.
Beijing Institute of Basic Medical Science，Beijing100850.
【Abstract】 Objective To clone mouse Secondary Lymphoid-tissue Chemokine（SLC），then construct the eukaryotic expression vetor of mouse SLC gene.Methods Totol RNA was extracted from the spleen tissue of a C57BL/6mouse by TRIzol reagent，the mouse SLC gene was cloned by reverse transcription-polymerase chain reacˉtion（RT-PCR）.Plasmid of pCI/GPI-Fc-Sig and pGEM-T easy-mSLC were digested by Nhe I/EcoR V to construct the intermedia plasmid pCI/GPI-Fc-mSLC for obtaining suitable multiple cloning site.pCI/GPI-Fc-mSLC and pcDNA3.1were further digested with NheI/NotI to construct recombinant pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc.The recombinants were screened by PCR，indentified by endounclease digestion;then positive clone was identified by sequencing.Results The nucleotide sequence of positive recombinant vector was completely correct.The402bp inˉserting fragment was comfirmed by both PCR method and endonuclease digestion.Conclusion The SLC gene was cloned from the C57BL/6mouse spleen tissue lymphocyte.The mouse SLC gene eukaryotic expression vector pcDˉNA3.1-mSLC-GPI-Fc was successfully constructed，and it set up the basis of the transfection of the eukaryotic expression cell and the further research in gene therapy.
Key words chemokine Secondary Lymphoid-tissue Chemokine（SLC） gene clone eukaryotic expression vector
次级淋巴组织趋化因子（Secondary Lymphoid-tissue Chemokine，SLC）是一种参与体内淋巴细胞归巢的趋化因子，它对体内包括T细胞、B细胞、NK和DC细胞在内的多种免疫细胞具有趋化作用 ［1］ 。由于上述免疫细胞在抗肿瘤的免疫应答方面起着关键作用，所以，克隆小鼠SLC基因并构建真核表达载体，对于进一步探讨小鼠SLC在真核细胞中的表达以及在未来肿瘤基因治疗研究中的应用，都具有重要意义。
1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/6小鼠，♀，7～8周龄，购自军事医学科学院实验动物中心。真核表达载体pcDNA3.1、感受态菌JM109、质粒pCI/GPI-Fc-Sig均为本实验室保存。pGEM-T easy vector试剂盒、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、dNTP购自Promega公司。Trizol RNA提取试剂盒、SuperScriptIII逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒为北京博大生物公司产品。限定性内切酶均购自美国BioLabs公司。引物由北京三博生物技术公司合成。DNA测序由上海博亚公司采用ABI310全自动DNA测序仪完成。
1.2 方法
1.2.1 小鼠SLC基因的克隆 根据GenBank小鼠SLC基因序列设计特异性引物，上游引物为:5’-CTCA GCTAGC ACCATGGCTCAGATGATGAC 3’（含Nhe I位点）;下游引物为:5’-GTTC GATATC TCCTCTTGAGGGCTGTGTC 3’（含EcoR V位点）。用Trizol RNA提取试剂盒提取C57BL/6小鼠脾脏组织淋巴细胞中的总RNA，再用SuperScriptIII逆转录试剂盒将上述总RNA中的mRNA逆转录成cDNA，并以其作为模板，应用上述合成的特异引物做PCR，扩增小鼠SLC基因。PCR反应条件为:预变性94℃5min;变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃1min。共35个循环。将扩增产物插入pGEM-T easy载体，构建重组质粒pGEM-T easy-mSLC，由上海博亚公司完成插入片段序列的测定。
1.2.2 真核表达载体的构建及鉴定 先用限制性核酸内切酶NheI/EcoRV分别双酶切质粒pCI/GPI-Fc-Sig和pGEM-T easy-mSLC，分别切胶回收约7400bp的pCI/GPI-Fc片断和402bp的mSLC基因片断，在T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，构建成pCI/GPI-Fc-mSLC重组质粒。再用NheI/NotI双酶切质粒pCI/GPI-Fc-mSLC和pcDNA3.1，切胶回收约2000bp的GPI-Fc-mSLC片断和已暴露NheI/NotI两个酶位点的质粒pcDNA3.1线性片断，通过T4DNA连接酶连接，16℃过夜，连接产物转化至JM109感受态菌，最后用下列方法进行筛选:挑取菌落，提取质粒后做PCR鉴定（扩增条件同基因钓取）、NheI/NotI双酶切、NheI/EcoR V双酶切和mSLC序列测定，最终确定已含有mSLC基因片断的真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc构建成功。重组质粒构建策略如图1。
2 结果
2.1 小鼠SLC基因克隆 自小鼠脾脏淋巴细胞中，经RT-PCR方法钓取小鼠SLC基因，电泳结果约为400bp左右，连接pGEM-T easy载体后，转化至JM109感受态菌，得到 23个克隆，随机筛选6个克隆，经菌落质粒PCR及NheI/EcoRV双酶切初步鉴定获得一株基因片段为400bp左右的克隆，再经DNA测序仪精密测序得到它的准确序列，通过在NCBI网站上Blast比对，发现所得序列完全与GenBank公布mSLC序列相同，证实这个基因确为小鼠SLC基因（图2）。
图1 真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc 构建流程（略）
图2 小鼠SLC基因序列图（略）
2.2 真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc的构建 按照方法1.2.2先将测序正确的mSLC基因与质粒pCI/GPI-Fc-Sig连接构建成pCI/GPI-Fc-mSLC载体，再经NheI/NotI双酶切后与pcDNA3.1质粒构建成pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc真核表达载体。转化至JM109感受态菌后筛得阳性菌，用mSLC特异引物做菌落的质粒PCR扩增出400bp左右的特异条带（图3）。用NheI/NotI双酶切，可切得约5.4kb和2kb的两条带（图4），其中2kb条带为mSLC-GPI-Fc片断;用NheI/EcoRV双酶切可获得约7kb和400bp的两条带（图5），其中分子量在400bp位置的条带为mSLC，初步证明插入基因正确。利用末端终止法测序，发现克隆的基因完全与网上mSLC碱基序列相同，故此进一步证实了真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc已成功构建。
图3 mSLC阳性克隆PCR结果（略）
注:1.pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc质粒PCR产物 2.Mark DL-2000
图4 NheI/NotI酶切pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc 鉴定结果图谱（略）
注:1.pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc质粒经NheI/NotI 双酶切产物;2.Mark DL-2000
图5 NheI/EcoRV酶切pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc 鉴定图谱（略）
注:1.pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc质粒经NheI/EcoRV 双酶切产物;2.Mark DL-2000
3 讨论
次级淋巴组织趋化因子（SLC）作为一种在细胞免疫过程中发挥重要作用的细胞因子已经越来越受到人们地重视，自1997年Nagira M首次发现SLC ［1］ 到现在的短短几年间，国外学者已经有研究证实了SLC在抗肿瘤免疫中的作用 ［2］ ，研究发现，SLC趋化的靶细胞是机体抗肿瘤免疫应答的主要效应细胞，在NK细胞、T细胞和DC细胞表面均表达SLC的受体CCR7，因此，SLC可以趋化这些效应细胞向 肿瘤局部迁移、浸润，从而起到明显的抗肿瘤作用 ［3～5］ 。所以，我们疫苗工程研究室克隆出的全长编码序列的小鼠SLC基因具有重要实际意义。构建出的小鼠SLC真核表达载体pcDNA3.1-mSLC-GPI-Fc可成功用于肿瘤基因治疗疫苗的研究中，为下一步转染肿瘤细胞系制备肿瘤疫苗打下坚实基础。
我们此次构建的真核表达载体具有独特之处，在这个载体上插入了锚定蛋白基因GPI和人IgFc段基因，这些基因的插入将在未来真核细胞膜表达以及疫苗制备工程中起到重要作用，其中GPI锚定蛋白的作用是对细胞表面进行修饰，通过GPI-锚定蛋白转移技术可以将与肿瘤免疫相关的多种细胞因子或抗原分子修饰锚定于肿瘤细胞表面，这样可以提高肿瘤疫苗的免疫原性 ［6］ ;人IgFc段基因表达蛋白以后，可以此作为标志，通过细胞免疫荧光染色的方法证明插入基因在真核细胞的表达。此真核表达载体的另一可取之处在于，在插入mSLC的NheI/EcoRV两个酶切位点位置上，可以替换为其他细胞因子基因如具有抗肿瘤活性的IFN-γ、IL-2、B7、IL-12等，这样可能在今后肿瘤疫苗工程研究中发挥多种细胞因子协同作战的重要作用。
参考文献
1 Nagira M，Imai T，Hieshima K，et al.Molecular cloning of a novel huˉman CC chemokine secondary lymphoid-tissue chemokine that is a poˉtent chemoattractant for lymphocytes and mapped to chromosome9p13.J Biol Chem，1997，272（31）:19518-19524.
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ˇ 基金项目:国家863计划资助项目［2001AA217131］
作者单位:100850北京军事医学科学院基础医学研究所疫苗工程研究室