高效液相色谱法测定阳春滴丸中淫羊藿苷的含量

【摘要】  目的 建立用高效液相色谱法测定阳春滴丸中淫羊藿苷的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法，Nova-PakC18 4um 3.9mm×150mm), 乙腈-水（25：75）为流动相，柱温：室温，检测波长为270nm，流速为0.8ml/min 。得回归方程Y=6E-06X-0.0099；相关系数r＝0.9998。回收率试验的平均加样回收率为98.85％，RSD＝0.68％（n＝5）。结论 所建立的方法简便、快速、准确，具有较好的重现性、稳定性，可用于阳春滴丸的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 淫羊藿苷 阳春滴丸

    阳春滴丸由水貂鞭粉、羊鞭胶、狗肾胶、鹿茸、首乌、山药、菟丝子、枸杞子、肉苁蓉、黄芪、熟地黄、阳起石、淫羊藿十三味药组成，并可衍生出许多加减方［1,2］。淫羊藿味辛，性温，有补肝肾，强筋骨，助阳益精，祛风除湿等功能。滴丸剂是一种固体分散体体系，具有溶出快、生物利用度高、疗效好、副作用小、药物稳定性好及制备简便等优点。特别是作为补阳类中药的滴丸剂因其具有起效快，作用持久的优势，克服传统中药起效慢的特点，有可能成为中药市场上的“伟哥”。

    阳春滴丸是根据江苏颐海药业有限责任公司生产的阳春胶囊研制而成，采用HPLC法测定阳春滴丸中淫羊藿苷的含量测定［3］，有效地控制了产品质量。

    1  仪器与试药

    waters515 高效液相色谱仪；waters2487 紫外检测器；Nova-PakC18 (4μm，3.9mm×150mm) 色谱柱。淫羊藿苷（批号：110737-200312  中国药品生物制品检定所）,对照品。阳春滴丸（批号：20050101 徐州颐海药业有限责任公司惠赠）；淫羊藿阴性对照（20050104批 徐州颐海药业有限责任公司惠赠）。甲醇为色谱纯，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为重蒸水。

    2  色谱条件的考察

    流动相的选择：（1）甲醇-水（51：49）时，峰形不好，未分离完全。（2）乙腈-水（30：70）时，出峰时间过短，约在4min左右，不能满足检测要求。（3）乙腈-水（25：75）时，出峰时间约在12min，分离度良好，峰形较对称。所以，确定了该比例的乙腈-水（25：75）的流动相，较为适宜。

    3  供试品溶液制备方法的优选

    3.1  供试品制备方法的确定  由于淫羊藿苷为一种极性较大的苷类物质，在有机溶剂（如甲醇，乙醇）和水中均有较大的溶解度，可以用超声提取法、索氏提取法等方法提取，其中超声法提取速度快，收率可能大大超过索氏提取法，故被许多中药分析过程选为供试样处理的手段。同时参考相关文献设计了以下3种方法对样品中的淫羊藿苷进行提取：

    （1）取本品适量，研细，取粉末约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精称，精密移取稀乙醇25ml,精称。超声1h，放冷，精称，用稀乙醇补足减失的重量。摇匀，滤过，精密移取续滤液10ml,加乙酸乙酯萃取4次，每次15ml。收集乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加稀乙醇适量溶解，转移至10ml容量瓶中，加稀乙醇至刻度，即得。

    (2)取本品适量，研细，取粉末约1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密移取稀乙醇25ml,精称。水浴回流1.5h，放冷，精称，用稀乙醇补足减失的重量。摇匀，滤过，取续滤液，即得。

    (3)取本品适量，研细，取粉末约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精称，精密移入稀乙醇25ml,精密称重。冷水超声30min，放冷，精称，用稀乙醇补足减失的重量。摇匀，滤过，取续滤液，即得。

    分别取3种方法项下供试液，用0.45μm微孔滤膜过滤，注入液相色谱仪测定，发现方法（1）分离度低，噪音较高，重现性差；方法（2）在与淫羊藿苷对照品相对应的保留时间无色谱峰出现；方法（3）分离度、理论数均符合要求，且具有良好的重现性，能够有效提取淫羊藿苷。故采用方法（3）制备供试品溶液。

    3.2  最终确立实验方法

    3.2.1  色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－水（25：75）为流动相；流速0.8ml/min。检测波长270nm。理论塔板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

    3.2.2  对照品溶液的制备  取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加流动相制成每毫升约含0.05mg的溶液，即得。

    3.2.3  供试品溶液的制备  取本品适量，研细，取粉末约1.0g，精密称重，置具塞锥形瓶中，精密量取稀乙醇25ml加入锥形瓶中，密塞。精密称定重量。冷水超声30min，放冷，精密称重，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

    4  方法学考察

    4.1  空白试验  按本制剂处方比例及制备工艺，不加入淫羊藿药材，制得缺淫羊藿的空白样品。按样品溶液制备方法制备空白对照溶液。分别精密吸取淫羊藿苷标准对照溶液、样品溶液和空白对照溶液各10μl，分别进样测定，可见：淫羊藿苷峰位在12min左右，样品溶液有同样的吸收峰，而空白溶液在相应位置无吸收，不影响淫羊藿苷定量。见图1～3。

    图1  淫羊藿苷对照品HPLC色谱图 图2  阴性对照HPLC色谱图图3  样品HPLC色谱图

    4.2  标准曲线的制备  精密称定80℃减压干燥至恒重的淫羊藿苷对照品适量，加流动相制成每1ml含0.056mg的溶液。分别精密吸取2、4、6、8、10μl注入液相色谱仪，测定，测得峰面积。对峰面积与进样量进行直线回归处理。得回归方程y=6E-06x-0.0099；相关系数r＝0.9998。表明淫羊藿苷进样量在 0.112～0.560μg之间与峰面积分值呈线性关系。见表1，图4。表1  线性试验

　　4.3  系统精密度试验  取0.056mg/ml的淫羊藿苷对照品溶液，精密吸取对照品溶液10μl注入液相色谱仪测定，连续进样6次，分别测定其峰面积。结果依次为1664327、1676957、1658418、1666887、1645027、1670088， RSD%为0.66%。结果表明系统精密度良好，符合规定。

    4.4  重复性考察       称取阳春滴丸样品5份，每份约1.0g，均精密称定，照测定法项下供试液制备方法进行处理，测定结果见表2。结果表明重复性良好。

    4.5  稳定性试验  按样品溶液制备方法制得供试溶液，精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪测定。分别于0、1、3、6、12、24h后测定1次。结果依次为750661、747855、743276、745815、748294、742394，RSD%为0.42%。表明供试溶液至少在24h内稳定。

    4.6  回收率试验  釆用加样回收试验方法，取已知淫羊藿苷含量的同批样品各5份（重复性试验项下），精密量取0.028mg/ml的对照品溶液5ml置入10ml容量瓶中，加入上述已知含量的溶液至刻度，即得。依法测定，计算回收率。结果见表3。表3  加样回收率试验结果 结果表明试验方法的回收率高，符合含量测定要求。

    5  讨论

    本法参照《中国药典》2005年版一部淫羊藿项下含量测定方法及药学文献，对流动相、样品处理方法进行了考察比较。经实际实验考察淫羊藿苷色谱峰分离情况和保留时间，当流动相比例为乙腈－水（25:75）,柱温室温，淫羊藿苷达到有效分离，保留时间合适。比较了萃取法、超声提取法、水浴回流法对样品进行提取处理，结果表明超声提取法效果最好。检测波长为270nm，与《中国药典》2005年版一部淫羊藿药材含量测定方法一致。采用本法测定阳春滴丸中淫羊藿苷含量简便、准确，可用于制剂质量控制。

    本品为滴丸剂，为剂改品种，由阳春胶囊改变剂型而来。本文在阳春胶囊质量标准研究的基础上建立了高效液相色谱法测定淫羊藿苷的含量方法。本品由13味中药组成，仅对其中淫羊藿苷含量进行考察，对制剂质量考察有一定的局限性，但方中含有多种动物及矿物原料，目前药理学研究对其中有效成分的研究还不成熟，不能在实际生产中应用，故仅选用方中具有代表性的植物原药材淫羊藿中的淫羊藿苷进行了含量测定。

【参考文献】
  1 卫生部药品标准.中药成方制剂,第二十册，1997，263.

2 国家药品标准.阳春胶囊（WS3-B-3834-98）.

3 国家药典委员会.中国药典，2000年版，一部.北京:化学工业出版社,2000.

作者单位：221000 江苏徐州，徐州市药品检验所