高效液相色谱法测定新疆大蓟中绿原酸的含量

【摘要】  目的 建立新疆大蓟中绿原酸的高效液相色谱测定法。方法 色谱柱为Dikma Kromasil ODS柱(250mm×46mm，5m)，甲醇-1%冰乙酸(25:75，v/v)为流动相，检测波长为327nm，流速为1.0ml/min。结果 绿原酸线性范围为16～160mg/L(r=0.9996，n=6)，平均回收率为96.7%，RSD为3.27%(n=6)。结论 本法简便易行、具有良好的准确度与重现性，适用于新疆大蓟中绿原酸的定量分析。

【关键词】  高效液相色谱法;新疆大蓟;绿原酸

　　【Abstract】 Objective To develop a HPLC method for the determination of chorogenic acid in cirsium japonicum in Xinjiang. Methods The chromatographic column was Dikma Kromasil ODS (250mm×4.6mm, 5 m). The mobile phase consisted of methanol-1% solution of glacial acetic acid (25:75). The flow rate was 1.0ml/min. The detective wavelength was set at 327 nm. Results The linearity was found in the range of 16~160mg/L (r=0.9996, n=6). The average recovery was 96.7% with RSD=3.27% (n=6). Conclusion The method is reliable, accurate and suitable for the determination of chlorogenic acid in cirsium japonicum in Xinjiang.

　　【Key words】 HPLC;cirsium japonicum;chlorogenic acid

　　大蓟为菊科植物蓟(Cirsium japonicum DC.)的干燥地上部分或根[1]，其性凉，味甘、苦，具有凉血止血、行瘀消肿功效，可用于治疗血热出血证及热毒痈肿[2]。大蓟在我国大部分地区多有分布，种类达上百种。在新疆，大蓟分布广泛，有16种之多，是维吾尔医常用药材。大蓟的有效成分主要有黄酮、黄酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质[3]。本文采用HPLC法测定新疆大蓟中绿原酸的含量，为制订新疆大蓟的质量标准并为评定该品种相关制品的质量提供可靠依据，为开发黄酮类化合物及综合利用新疆维吾尔医药资源提供理论和实验依据。

　　1 实验部分

　　1.1 仪器与材料

　　岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，包括LC-10ATvp输液泵、SPD-10A紫外-可见检测器(日本岛津公司)，Anastar色谱工作站(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);岛津UV-260型紫外-可见分光光度计 (日本岛津公司)，KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

　　绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0753-200212)、新疆大蓟(采于新疆和田于阗县)，经鉴定为丝路蓟(Cirsium arvense);二次蒸馏水(自制);甲醇，冰乙酸为分析纯。

　　1.2 溶液的制备

　　1.2.1 对照品溶液的制备

　　精密称取真空干燥至恒重的绿原酸对照品16.02mg，置100ml棕色量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml中含绿原酸160.2mg/L的对照品溶液。冰箱(4℃)保存，于1周内使用。

　　1.2.2 供试品溶液的制备

　　取大蓟粉末(过60目筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚25ml，超声处理15min，取出，放冷，弃去石油醚，残渣晾干后精密加入70%甲醇25ml，精密称重，超声处理45min，取出，放冷，再精密称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过(0.45μm)，取续滤液作为供试品溶液。

　　1.3 色谱条件

　　色谱柱：Dikma Kromasil ODS柱(250mm×4.6mm，5m，迪马公司);流动相：甲醇-1%冰乙酸水溶液(25:75，v/v)，流速：1.0ml/min;检测波长：327nm。

　　2 结果

　　2.1 线性关系

　　精密量取对照品溶液1、2、4、6、8、10ml，分置10ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下进样10μl，记录色谱图，以峰面积为纵坐标(Y)，绿原酸浓度(mg/L)为横坐标(X)进行线性回归，得绿原酸回归方程：Y=32687X-1572，r=0.9998;线性范围16~160mg/L。

　　2.2 精密度

　　精密吸取对照品溶液(64.08mg/L)10μl，重复进样5次，记录色谱图，量取峰面积，计算绿原酸峰面积的RSD为0.48%(n=5);取供试品5份，每份约1.0g，照“供试品溶液的制备”项下方法操作，分别进样10μl，记录色谱图，用峰面积照标准曲线法计算供试品中绿原酸的平均含量为1.23mg/g，RSD为1.58%(n=5)。本法的系统精密度与方法重现性符合定量分析要求。

　　2.3 稳定性

　　取供试品溶液每隔2h进样10μl，连续进样6次，分别记录色谱图，量取峰面积。在12h内绿原酸平均峰面积的RSD为0.98%(n=6)。结果表明供试品溶液在12h内稳定。

　　2.4 回收率

　　精密称取已知含量的样品1.0g，精密加入对照品溶液5、7.5、10ml各2份，各精密加入70%甲醇20、17.5、15ml，照“供试品溶液的制备”项下方法操作，分别进样10μl，记录色谱图，用峰面积照标准曲线法计算各供试品中绿原酸的含量及方法回收率，求得绿原酸平均加标回收率为96.1%，RSD为1.92%。回收率试验结果见表1。表1 绿原酸加标回收率测定结果

　　2.5 样品测定

　　取供试品5份，每份约1.0g，照“供试品溶液的制备”项下方法操作，分别进样10μl，记录色谱图，用峰面积照标准曲线法计算供试品中绿原酸的含量，结果见表2。标准溶液和供试品溶液色谱图如图1所示。表2 样品测定结果　图1 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图

　　3 讨论

　　经紫外光谱测定，绿原酸在327nm有最大吸收，故选择327nm为检测波长。曾以50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇和70%乙醇作为提取溶剂分别进行超声和回流提取，结果以70%甲醇超声提取为最佳，乙醇提取液的杂质峰太多，分离效果差。试验中曾使用甲醇-1%冰乙酸(20:80;25:75;30:70)、甲醇-0.5%磷酸(25:75)作为流动相，发现以甲醇-1%冰乙酸(25:75)为最佳。实验中通过调节流动相的pH，抑制样品组分的解离，改善了峰形[4，5]。

【参考文献】
  　1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:化学工业出版社，2005.

　　2 高学敏.中药学.北京:中国中医药出版社，2005：337.

　　3 陈凯云,罗小泉,陈海芳,等.中药大蓟的研究进展.江西中医学院学报,2007,19(4):80-81.

　　4 张潇,李蓉.高效液相色谱法测定大蓟中绿原酸的含量.药物检定,2009,18(21):25-26.

　　5 贺浪冲,耿信笃.一些酸性药物在正相硅胶/反相洗脱色谱中保留机理研究.药学学报,1998,33(1):42-43.