点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨促肾上腺激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）刺激腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径。方法 利用拮抗剂分别拮抗巨噬细胞的CRH-R1、CHR-R2受体、cAMP和PKA磷酸化后，检测CRH刺激后巨噬细胞分泌TNF-α的含量和观察CRH-R1、CRH-R2、P-PKA和P-CREB在细胞中分布的变化。结果 正常巨噬细胞中有CRH-R1、CRH-R2和P-PKA的染色颗粒，而无P-CREB染色;CRH刺激后，CRH-R1、CRH-R2、P-PKA染色加深，并出现P-CREB染色颗粒。拮抗CRH-R1组、拮抗CRH-R2组和正常对照组之间无统计学差异，三组均显著低于CRH刺激组（P<0.01）;cAMP拮抗组低于正常组（P<0.01）;拮抗PKA组明显高于其他各组（P<0.01）。结论 CRH-R1、CRH-R2均参与了CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的过程。第二信使cAMP可能是CRH调节巨噬细胞产生TNF-α的关键。PKA信号途径可能与CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α过程的抑制途径有关。
关键词 CRH 巨噬细胞 TNF-α 信号转导
A Preliminary sudy on the pathway of signal transduetion throughwhich the
macrophages of the abdominal cavity are stimulated by CHR to secrete TNF-α
Chang Jinping，Zhou Jihong，Liu Baohua，et al.
Institute of Field Surgery of Daping ospital of3n Mititary Medical offieer University，Chongqing400042.
【Abstract】 Objective To investigate the pathway of signal transduction which macrophages secrete TNF-αafter CRH stimulated.Methods We adopted different
antagonists to antagonize the CRH-R1，CRH-R2，phosphoˉrylated of cAMP or PKA separately.Then we detected the content of TNF-αin superior fluid of cultured macrophages in different time after CRH stimulated，and we observed the changes of
distribution of CRH-R1，CRH-R2，P-PKA，P-CREB in marophages at the same time.Results The color granules of CRH-R1，CRH-R2and P-PKA were discovered in cytoplasmia of the normal macrophages.The colors of the three granules were deepened aferCRH stimulated.The buffy granules of P-CREB were discovered in macrophages after CRH stimulated too.There were not statistical discrepancies among the antagonist-CRH-R1group、the antagonist-CRH-R2group and the normal group;but the contents of TNF-αof the three groups significantly decreased compared with the CRH stimulated group（P<0.01）.The antagonist of cAMP groups significantly decreased compared with normal contrl group（P<0.01）.The contents of TNF-αof antagonist of PKA group significantly increased Compared with the other groups（P<0.01）.Conclusion CRH-R1and CRH-R2both participate in the process of which CRH stimulate macrophage to secrete TNF-α.The second messenger cAMP may be the key for CRH to regulate macrophage to produce TNF-α.The signal transduction way of PKA may be concerned with the restraining pathway of which CRH stimuate macrophage to secrete TNF-α.
Key words CRH macrophage TNF-α signal transduction
目前对促肾上腺激素释放激素（CRH）刺激细胞产生的生理效应机制主要集中在对中枢神经细胞的研究上，其机制是通过Gs［激活性G蛋白-有介导激活腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）的作用］系统来作用。但对CRH在外周的直接免疫调节功能的机制尚无报道。本实验第一次利用不同的拮抗剂来观察巨噬细胞在CRH刺激下分泌TNF-α的含量变化和其免疫细胞染色，以探讨CRH直接调节巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径，以便找出CRH是如何直接参与调节免疫反应的。
1 材料和方法
1.1 腹腔巨噬细胞的培养 按参照的方法 ［1］ ，断颈处死的成年健康Wistar雄性大鼠（第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物室提供），在腹膜上剪开一小孔，注入预冷的D-Hanks液10ml，轻柔按摩腹壁5次，吸出灌洗液约5ml，800rpm离心5min，弃上清液，加入含10%小牛血清（Hyclone美国）的RPMI1640培养液（Gibco美国），轻轻吹打成均匀的细胞悬液。台盼蓝（Sigma美国）测定细胞活性计数，调整细胞浓度至5×10 6 /ml。接种于放有盖玻片的24孔培养板内，置于37℃、5%CO 2 、95%湿度的培养箱内培养（Shellab美国）。培养贴壁2h后，弃培养液，用预冷的PBS洗涤培养孔，去除未贴壁的细胞，贴壁者即为巨噬细胞。
1.2 实验分组和取材 取培养2h的巨噬细胞，随机分为以下6组:正常对照组（NG）、CRH刺激组（CRHG）、拮抗CRH-R1受体组（CPG）、拮抗CRH-R2受体组（CRG）、拮抗cAMP组（H89G）和拮抗PKA组（PKAG）。NG加入等体积的正常培养液;CRHG中加入含终浓度为10 -9 M的CRH（Calˉbiochem公司）的培养液 ［2］ ，CPG中加入含10 -9 M的CRH和5×10 -4 M的CP154526（辉瑞公司赠送）的培养液 ［3］ ，CRG的培养液中加入含10 -9 M的CRH和10 -6 M的CRH9-41（Calˉbiochem公司）的培养液 ［4］ ，H89G中加入含10 -9 M的CRH和10-6 M的H89（Calbiochem公司）的培养液 ［5］ ，PKAG中加入含10 -9 M的CRH和10 -4 M的PKA拮抗剂6-22（Calˉbiochem公司）的培养液 ［6］ ，分别于培养0.5h、1h、2h、4h和8h取培养细胞上清液和培养的巨噬细胞。
1.3 CRH-R1、CRH-R2、P-PKA、P-CREB的免疫细胞化学染色 其中一抗工作液浓度分别为:CRH-R11:400;CRH-R21:400;P-PKA1:300;P-CREB1:300。二抗为生物素化山羊抗大鼠IgG（北京中山生物公司），浓度为1:100。于显微镜下观察，以细胞膜或细胞核出现棕褐色颗粒为阳性判定标准。
1.4 TNF-α含量的测定 按TNF-α（Dlaclone，法国）试剂盒说明书测培养细胞上清液内TNF-α含量。
1.5 统计学处理 实验所得计量资料用均数±标准差表示（X±s），采用SPSS10.0软件进行配对资料的t检验的统计学分析，P<0.05表示有明显统计学意义，P<0.01表示 有非常明显的统计学意义。
2 结果
在正常的巨噬细胞的胞浆内均有CRH-R1和CRH-R2两种受体分布，其阳性产物染色呈棕黄色颗粒，并在CRH刺激后着色加深，见图片1。正常的巨噬细胞胞浆内有P-PKA的浅黄色颗粒出现，而无P-CREB染色;CRH刺激后，细胞的胞浆、胞核内均有两者的棕黄色颗粒出现，并胞核染色均强于胞浆，尤其以P-CREB的细胞核膜深染，见图片2。
CRHG各时相点TNF-α的含量均显著高于正常对照组（P<0.01），并随CRH的刺激时间延长，分别于1h和8h上升的幅度最大，于8h到达峰值（P<0.01），见表1。
CPG和CRG分泌的TNF-α量无统计学差异，与NG之间也无统计学差异。但两组与CRHG有显著差异（P<0.01），尤其在1h和8h抑制CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的上升幅度最大，见表1。
H89能明显抑制CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α，尤其在8h H89G明显低于NG和CRHG。另外，该组分泌的TNF-α明显低于PKAG分泌的量（P<0.01），见表1。
PKAG的巨噬细胞分泌的TNF-α明显高于其他各组（P<0.01），为NG的4.8～15倍;为CRHG的2.4～12倍;其中在0.5h最为突出分别为NG的15倍，CRHG的12倍，见表1。
表1 不同拮抗剂对CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的影响 略
3 讨论
CRH主要是通过与CRH-R1受体或CRH-R2受体结合后通过Gs来激活腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）系统来传导信号，其中第二信使环腺苷一磷酸（Cyclic adenoˉsine monophosphate，CAMP）和cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response-element binding protein，CREB）是这一信号通路的关键环节 ［7～9］ 。在CRH对中枢神经细胞的信号通路的研究中，CRH-R1是主要的受体。但Agelaki等人利用体内和体外的模型发现在内毒素休克早期，CRH-R1受体被拮抗后，可以抑制内毒素诱导的巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的升高 ［9］ 。
我们利用体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞和不同的拮抗剂来初步研究CRH刺激巨噬细胞分泌TNF-α的信号途径。发现CRH-R1和CRH-R2两种受体均存在于巨噬细胞胞浆内，当CRH刺激后，胞浆内的两种受体表达明显增加。而CRH-R1受体拮抗剂CP154526和CRH-R2受体拮抗剂CRH9-41均能有效降低CRH刺激这两组的巨噬细胞 分泌TNF-α，尤其在上升幅度最大的两个