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ˇ 基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助课题（No:97B09）
【摘要】 目的 研究大黄素的抗肝纤维化作用及其可能机制。方法 （1）采用四氯化碳皮下注射法制备肝纤维化动物模型，并给予不同剂量的大黄素进行干预;（2）分离、培养大鼠肝星状细胞（HSC）并以大黄素干预。结果 大黄素明显降低肝纤维化程度，改善肝功能，抑制肝组织转化生长因子-β 1 （TGF）、α-平滑肌肌动蛋白表达（SMA），并对培养的肝星状细胞增殖及胶原合成有抑制作用。结论 大黄素具有抗肝纤维化作用，其机制包括保护肝细胞、抑制TGF-β 1 产生、抑制HSC活化。
关键词 大黄素 肝纤维化 转化生长因子-β 1 α-平滑肌肌动蛋白 肝星状细胞
Effect and mechanism of emodin on experimental hepatic fibrosis
Zhan Yutao，Li Dingguo，Liu Bin，et al.
Beijing Tongren Hospital，Capital University of Medical Sciences，
Beijing100730
【Abstract】 Objective To study the effect of emodin on CC14-induced hepatic fibrosis in rats and its mechˉanism.Methods Rat hepatic fibrosis model was induced by injection of CC14and treated with emoding.Hepatic stelˉlate cells were cultured and intervened with emodin.Results Emodin could reduce the degrees offibrosis，improve liver function，inhibit the expression of liver transforming growth factor-β1andα-smooth muscle actin in hepatic fiˉbrosis rats，as compared with those in untreated model rats.It could also inhibit the proliferation andcollagen synthesis of cultured HSCs.Conclusion Emodin has antihepatofibrotic effect in rats，and the mechanism of such action consists of protecting hepatocytes from toxic injury，inhibiting transforming growth factor-β1synthesis，slowingHepatic stellate cells activation.
Key words emodin hepatic fibrosis transforming growth factor-β1 α-smooth m
uscle actin hepatic stellate cells
肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经病理阶段，迄今国内外仍无理想的防治措施，探讨中草药及其有效成分治疗肝纤维化已成为国内防治肝纤维化研究的热点之一。大黄素是大黄中的一个主要有效成分，根据大黄素药理作用很可能具有抗肝纤维化作用，为此，我们应用大鼠肝纤维化模型研究了大黄素对肝纤维化形成的影响，并对其作用机制进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 大黄素:南京药科大学植化室提供;四氯化碳（CCl 4 ）:上海长江化工厂产品;橄榄油:上海化学试剂供应站分装厂产品;TGF-β 1 多克隆抗体:武汉博士德生物技术公司产品;α-SMA试剂盒:福州迈新生物技术开发公司;链霉蛋白酶:Sigma公司产品;Ⅳ型胶原酶:Sigma公司产品;Nycodenz:Sigma公司产品; 3 H-脯氨酸:中国原子能科学研究院产品。
1.2 动物实验
1.2.1 动物模型及分组 纯系、雄性SD大鼠48只（中国科学院上海实验动物中心提供），体重185±23g。大鼠肝纤维化模型制备:首次以0.5ml/100g体重皮下注射，以后以 0.3ml/100g体重注射，3天1次，共42天。实验分组:（1）正常组（8只）;（2）模型组（10只）;（3）小剂量大黄素组（20mg/kg体重，10只）;（4）中剂量大黄素组（40mg/kg体重，10只）;（5）大剂量大黄素组（80mg/kg体重，10只）。大黄素组按模型组法制备纤维化模型，并同时给大黄素混悬液灌胃，每天1次。
1.2.2 肝功能检查 采用自动生化分析仪测定肝功能指标。
1.2.3 肝组织病理学检查 肝组织标本用10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm连续切片，行VG和HE染色。光镜下观察HE及VG染色肝组织切片，将纤维增生程度分为0～4级 ［3］ :0级:无纤维化;1级:纤维结缔组织只局限于汇管区或有汇管区扩大，有向小叶发展倾向;2级:纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3及有1级同样的改变;3级:纤维结缔组织增生进入小叶达中央静脉周围;4级:纤维结缔组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成，并有3级同样的改变。
1.2.4 肝组织TGF-β 1 及α-SMA的表达检测 通过免疫组化方法检测各组大鼠肝组织TGF-β 1 及α-SMA的表达，并通过图像分析对其进行定量研究。
1.3 体外实验
1.3.1 大鼠HSC的分离 通过门静脉插管，经链酶蛋白酶及Ⅳ型胶原酶两步原位循环灌注法及Nycodenz密度梯度离心法分离HSC。
1.3.2 实验分组 培养7天后按下列分组（每组12复孔，6复孔用于细胞胶原合成测定，另6复孔用于细胞增殖测定）进行处理:（1）对照组;（2）小剂量大黄素组（5mg/L）;（3）中剂量组大黄素组（10mg/L）;（4）大剂量大黄素组（20mg/L）。
1.3.3 细胞胶原合成的测定 按以上分组施加处理因素作用24h后，各组6复孔加入 3H-脯氨酸（10ci/ml）继续培养24h，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA液消化细胞脱离孔壁，将细胞移于F 49 型纤维滤膜上，经生理盐水洗涤后以10%三氯醋酸固定18h，再以5N HCl脱水，70℃烤箱中烘1h，然后置于闪烁瓶中并加闪烁液3ml，用闪烁仪测cpm。
1.3.4 细胞增殖的测定 按以上分组施加处理因素，置36.5℃、湿度96%、5%CO 2 培养箱中共同培养24h，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA液消化细胞脱离孔壁，4℃PBS洗涤2次（1500r/min离心，5min），加入80%冷乙醇固定，置4℃冰箱中过夜。检测前用PBS洗涤2次，再用PBS调整细 胞浓度为5×10 5 /ml，取200μl细胞悬液，加1%RNA酶溶液100μl，37℃中孵育15min，洗去RNA酶，加PI1ml，室温下避光30min，即可在流式细胞仪上检测。
1.4 统计方法 计量资料采用t检验;计数资料应用Ridit检验法。
2 结果
2.1 大黄素对肝纤维化形成的影响 正常组肝脏肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射样排列，板间有不规则肝窦，肝小叶内网状纤维支架完整，分布规律，无胶原纤维存在。模型组肝小叶结构破坏，纤维结缔组织增生，假小叶形成（照片1）。大黄素组纤维结缔明显减少，未见明显的假小叶形成（照片2）。各组肝纤维化分级评分见表1，与模型组比较，大黄素组肝纤维化分级评分显著降低，以中、大剂量组为著（P<0.01），提示大黄素能明显改善肝纤维化程度。表1 大黄素对肝组织纤维化分级的影响组别 n（略）
2.2 大黄素对肝功能的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清谷丙转氨酶（ALT）及碱性磷酸酶（AKP）显著升高（P<0.001）;总蛋白（TP）及白蛋白（ALB）显著降低（P<0.05，P<0.01）;球蛋白（G）升高，但无统计学差异。与模型组比较，大 黄素组大鼠血清ALT、AKP显著降低（P<0.05，P<0.01）;TP、ALB显著升高（P<0.05，P<0.01）;球蛋白（G）降低，但无统计学差异，见表2。表2 大黄素对肝损伤大鼠肝功能的影响组别
2.3 大黄素对肝组织TGF-β 1 表达的影响 正常组的大鼠肝组织几乎不表达TGF-β 1 ，模型组TGF-β 1 表达明显，主要分布于汇管区血管周围的纤维组织中及肝包膜下（照片3），大黄素组TGF-β 1表达较模型组明显减少（照片4），图像分析结果表明，大黄素组TGF-β 1 染色面积较模型组显著减少（P<0.01～0.001），见表3。
2.4 大黄素对肝组织α-SMA表达的影响 免疫组化染色表明，正常组α-SMA表达分布于血管壁。模型组大鼠α-SMA表达除血管壁表达外，纤维间隔区域表达显著增强，尤以靠近中央静脉的纤维间隔区为著（照片5）。大黄素治疗组α-SMA表达减弱（照片6），血管壁周围有少量的间质细 胞表达，各组大鼠肝组织α-SMA表达情况见表4。表3 大黄素对肝组织TGF-β 1 表达的影响 （略）注:与模型组比较， ˇ P<0.01， ˇˇ P<0.001表4 大黄素对肝组织α-SMA表达的影响 （略）注:与正常组比较， ˇ P<0.0001;与模型组比较， △ P<0.01， △△ P<0.001
2.5 大黄素对HSCs增殖的影响 图1显示，对照组进入G 1 、S期及G 2 期的细胞分别占51.1%、30.5%及11.2%，大黄素组67.7%～75.6%的细胞进入G 1 期、12.8%～18.3%的细胞进入S期、5.1%～8.3%的细胞进入G 2 期，提示大黄素能延缓HSC G 1 →S的进程，抑制HSC增殖。
2.6 大黄素对HSC胶原合成的影响 不同浓度大黄素与HSC共同孵育24h，其 3 H-脯氨酸掺入闪烁值见表5。所用三种浓度大黄素均能显著抑制 3 H-脯氨酸的掺入（P<0.05～0.01），且随着浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。表5 大黄素对HSC 3 H-脯氨酸掺入的影响 （略）
3 讨论
大黄素系单蒽核类1，8—