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关键词 贫血 再生障碍性 T淋巴细胞 CD 28 FasL
Association between abnormal T lymphocytes and aplastic anemia
Liu Xiaoli，Zhang Maohong，Xu Conggao，et al.
Dept.of Hematology，Xinhua Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai200092.
【Abstract】 Objective To study the association between abnormal T lymphocytes and aplastic anemia（AA）.Methods The expression of CD28on CD 3+ T cells and the expression of FasL on CD 8+ T cells were both assayed by FACS.Results The expression of CD28on CD 3+ T cells in AA patients increased significantly，and there was negaˉtive correlation between the expression of CD 28 and the level ofhemoglobin.The expression of FasL on CD 8+ T cells in AA patients was also muchhigher than normal controls.Conclusion The CTL cells in AA patients are activated exˉcessively in the bone marrow so that they can attack the hemapoitic stem cells directly.T lymphocytes play an imporˉtant role in the pathogenesis of AA.
Key words anemia/aplastic T lymphocyte CD28 fasL
再生障碍性贫血（再障，AA）是一组异质性疾病，其病因学不明，基本的病理生理异常是骨髓中造血干细胞减少，但是越来越多的研究表明，免疫系统紊乱特别是T淋巴细胞的数量和功能异常所造成的造血抑制在再障的发生、发展中起着重要的作用 ［1］ 。我们采用流式细胞术检测了再障患者骨髓T淋巴细胞的功能，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 检测对象 21例再障患者均符合1987年第四届全国再障会议修订的诊断标准 ［2］ 。其中慢性再障（CAA）15例，重型再障（SAA）Ⅰ型3例，Ⅱ型1例，纯巨核再障2例;男12例，女9例;年龄12～67岁，中位年龄35.5岁，病程10余天～10余年。所有患者取标本前3个月内均未用免疫抑制剂治疗，其中3例未进行FasL的检测。对照组骨髓标本10例，取自胸外科手术切除肋骨，并已证实患者为非血液、非免疫系统疾病。
1.2 试剂 FITC标记鼠抗人CD 3 抗体、PE标记鼠抗人CD 28 抗体;鼠IgG1-FITC、IgG1-PE，均为PharMingen Internaˉtional公司产品。PE标记鼠抗人CD 8 抗体，鼠抗人FasL抗体、FITC标记羊抗鼠IgG 1 ，Immunotech公司产品。
1.3 仪器 流式细胞仪:FACS Vantage，BD公司产品。
1.4 标本处理 取肝素抗凝新鲜骨髓标本5ml，分离单个核细胞（BMMNC），调整细胞浓度为1×10 7 /ml，供流式细胞仪分析。
1.5 检测方法 采用双色解析流式细胞术。检测CD 3+ T细胞表面CD 28 的表达采用直接标记法，设实验管和对照管，每管加1×10 6 个BMMNC，实验管加入FITC-CD 3 /PE-CD 28 抗体，对照管中加入鼠IgG1-FITC和IgG1-PE20μl，混匀，室温避光孵育30min，加入溶血素2ml混匀，10min后离心，用PBS2500rpm离心10min后洗涤2遍，弃上清，加入1ml PBS将细胞悬浮，上机检测。检测CD 8+ T淋巴细胞表面的FasL时采用间接标记法，BMMNC悬液中先加入0.5%多聚甲醛-PBS，固定10min，离心，加入0.1%Triton X-100-PBS打孔，3min后洗涤2遍，加入鼠抗人FasL抗体，室温避光孵育30min，离心，用PBS洗涤2遍，加入FITC标记的羊抗鼠IgG1抗体，室温避光孵育30min，洗涤4遍，加入小鼠血清30min，洗涤3遍，加入PE标记鼠抗人CD 8 抗体，室温避光孵育30min，余步骤同上。激光光源为氩离子激光器，激发波长为488nm。利用CellQuest软件进行资料采集和分析，用前向角散射对侧向角散射散点图区分血细胞群体，用门技术（gating）圈出淋巴细胞群体。每份标本检测10000个细胞。计算各阳性细胞群体的比例。检测CD 8+ T细胞表面FasL的表达采用间接标记法。
1.6 统计学分析 数据以均值±标准差表示，数据分析根据方差齐性与否采用F检验，组间比较采用两样本均数的t检验，0.05为显著性水平界值。两者间关系采用相关分析，r为相关系数，显著性检验采用t检验，0.05为显著性水平界值。
2 结果
2.1 再障患者骨髓CD 3+ T细胞表面CD 28 的表达 以CD 3+ CD 28 + 占CD 3+ 细胞的百分率来对骨髓CD 3+ T细胞表面CD 28 的表达水平进行分析。再障组CD 3+ CD 28 + 百分率明显高于正常对照组（P<0.01）。有38.1%的患者CD 28 的表达率高于对照组的均数加2s。再障患者CD 28 的表达率与血红蛋白含量呈显著负相关（r=-0.684，P<0.001）。
2.2 再障患者骨髓CD 8 + T细胞表面FasL的表达 以CD 8+ FasL + 细胞占CD 8+ 细胞的百分率来分析骨髓CD 8+ T细胞表面FasL的表达水平。正常骨髓CD 8+ 细胞上FasL表达较低，而再障组FasL表达显著增高，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。
表1 再障患者骨髓T细胞表面CD 28 、FasL的表达
3 讨论
T淋巴细胞是细胞免疫中的主要效应细胞，研究发现再障患者不仅存在T细胞数量异常，而且T细胞亚群分布、表型和功能也有明显改变 ［3］ 。已有学者用分子生物学方法证实了再障患者骨髓中的T淋巴细胞呈显著克隆性增生，并有作者检测了再障患者骨髓活检标本显示再障患者骨髓T淋巴细胞处于活化状态。T细胞活化需要T淋巴细胞同时接受两个信号:一是T细胞上的TCR受体识别和结合APC提呈的MHC限制性抗原多肽，为第一信号;二是APC细胞上的B 7 分子与T细胞上的CD 28 分子结合产生的第二信号，称为共刺激信号。TCR与抗原结合启动T淋巴细胞的活化过程后，CD 28 与B 7 分子结合可上调IL-2、IL-2R、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α等的表达，促使细胞从G 0 期进入G 1 期，而且还在诱导CD 8+ CTL的产生中发挥作用，因而CD 28 分子的表达水平反映了T淋巴细胞的功能状态。我们检测了再障骨髓CD 3+ T细胞上CD 28 分子的表达，发现再障患者CD 28 分子的表达率显著增高，并且，CD 28 的表达率与血红蛋白含量呈显著负相关（r=-0.684，P<0.001），提示CTL细胞在骨髓受到抗原刺激后，由于共刺激信号增强，在局部过度活化增殖，产生和分泌大量的造血负调控因子，从而显著抑制造血功能。根据上述研究结果，我们可以设想，应用抗CD 28 Fab段或抗B 7 抗体阻断共刺激通路，抑制T淋巴细胞活化，可能会对改善再障的骨髓造血功能有一定作用，但对这一设想的可行性仍需要进行大量的研究。
活化的CTL或NK细胞采用两种方法攻击靶细胞，一是依赖穿孔素来传递杀伤因子，二是FasL作为效应分子来诱导表面有Fas的靶细胞进入凋亡。CTL细胞膜表面FasL 与靶细胞表面Fas结合，向靶细胞内传递死亡信号，细胞在数小时内发生凋亡 ［4］ 。研究发现再障患者骨髓CD 34 + 细胞的凋亡率增加，而且凋亡比率高低与临床病情严重程度相关 ［5］ 。这表明细胞凋亡与再障患者骨髓中造血干/祖细胞数量缺乏有关。那么，再障患者骨髓细胞凋亡的机制是什么呢?Maciejewski等 ［6］ 研究发现正常人CD 34 + 细胞上Fas表达很低，再障患者急性期骨髓CD 34 + 细胞Fas表达增加，而恢复期降低，但仍高于正常对照，其对抗Fas抗体敏感性增加。Fas的表达则为活化T细胞的毒性效应分子FasL提供了合适的靶分子。我们研究发现正常骨髓CD 8+ T细胞上FasL的表达较低，而再障患者骨髓CD 8+ T细胞上FasL表达明显增加，有4例患者治疗后FasL的表达降低，由于病例数太少，未进行统计。这一结果不但证实了再障患者骨髓内CTL细胞处于活化状态，而且提示再障患者造血干/祖细胞减少的主要机制可能是T淋巴细胞受到造血干细胞表的抗原刺激而活化增殖，淋巴因子分泌失调，产生过量的IFN-γ和TNF-α等造血负调控因子，显著上调CD 34 + 细胞上Fas抗原的表达，同时CD 34 +细胞对凋亡的敏感性增加，从而使造血干细胞成为表达大量FasL的活化CTL的靶细胞，Fas和FasL的相互作用导致骨髓CD 34 + 细胞快速凋亡。当造血干细胞的凋亡过多过快或者巨噬细胞功能缺陷不能及时吞噬凋亡小体，凋亡小体破裂可能会暴露和释放更多的自身抗原，而持续激活CTL细胞。因而即使起始抗原的刺激作用可能较小，但自身抗原的暴露会造成抗原刺激级联反应，从而导致大量的造血干细胞进入凋亡。对Fas介导的凋亡不敏感的细胞逃避了CTL的杀伤，异常克隆性增生，可能发展成为阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）或骨髓增生异常综合征（MDS）。我们未发现FasL的表达与血红蛋白、白细胞或血小板有明显的相关性，提示造血干细胞的减少除了与Fas/FasL途径介导的凋亡有关，还与造血负调控因子等因素的直接抑制作用有关。
由此可见，T淋巴细胞功能异常在再障的发生、发展中起着非常重要的作用，因而探讨T淋巴细胞的异常可以进一步阐明再障的免疫发病机制，并为寻找有效治疗方案提供理论依据。
参考文献
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