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Jiang Hanying，Yu Yuan，Zhang Weijie，et al.
Department of Clinical Pharmacdogy of Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology（HUST），Wuhan430030.
【Abstract】 Objective Greftt hombosis is the main Cause of early graft failure in discordant xenotranshplanˉtation.Altered endothelial cell（EC）production of thromboactive substance may play a primary role in this prodcedure.Methods To evaluate the potential role of nature antibodies and complement in hyperacut xenograft rejection we therefore investigated the effect of varing components of human serum on EC production of Prostacyclin（PGL2）apotent endogenous antagonis of platelet aggregation and vasodilator Confluent monolayers of pig aortic endothelial cell at stage three wereincubated for1or2hr in a Medium199contain0，10%fetal calf serum（FCS），25%Mixed fresh human sera（HS）25%heatinactivated pooled humanserum（HIHS），25%newborn sera.Results Test supernalant were then assayed by RIA for6-keto-PGFLa，the stable metabolite of PG12.The result of these experiment shown that fresh human serum inhibits PG12production and stimulates LDH release from PAECHowever，heat inactivated serum and newborn sera（without IgM）haven’t hthis cytotoxic activity.This findings suggest that inhibite endothelial PC12proˉduction by human natural igM antibodies and complement may be a critical step in the pathogenesis of hyperacute xenograft rejection.Conclusion This model may be benifical for studing the mechanism of thrombosis in HAR and new antithrombosis drugs.
Key words xenotransplantation hyperacture rejection reaction natural antibody
血栓形成是导致非协调性异种移植（discordant xenoˉtransplantation）早期失败的主要原因，现认为与移植物内皮细胞激活和抗血栓功能受损有关 ［1］ 。正常静息状态的血管内皮细胞具有屏障和抗凝功能，内皮细胞由天然抗体和补体刺激激活后失去屏障作用并转为促凝状态，导致血栓形成和出血 ［1］ 。前列环素（PGI 2 ）是近年特别受人注意的抗血栓物质，主要由内皮细胞合成，具有强大的扩血管作用和抗血小板聚积作用。前列环素生成减少可能在异种移植血栓形成过程中起重要作用。为了证实这个现象，本文采用体外猪主动脉内皮细胞培养实验，首次观察成人血清（含IgM、IgG和补体）、和灭活后成人血清（含IgM和IgG）、新生儿血清（不含IgM，含IgG和补体）对猪主动脉内皮细胞PGI 2 合成的影响和损伤作用，以探讨未来猪对人异种移植发生超排中血栓形成的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 M199粉，胰蛋白酶和胎牛血清（均购自美国GIBCO公司）;第Ⅷ因子检测试剂（上海生物制品研究所）;6-keto-PGF1α 125 I标记药盒，购自中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所。
1.2 人血清来源 新鲜成人血清取自健康献血者，共24 人，男女各半。其中“O”型18人，“A”、“B”、“AB”型各2人，每人5ml。静置1hr后，离心分离血清后混匀。一半灭活处理（56℃，30min）。滤菌后分装-30℃保存。新生儿血清取自初产妇脐带血，8份，每份各10ml。同上法分离血清后混匀，滤菌后分装冻存。
1.3 猪主动脉内皮细胞培养 参考Starzl TE等人方法 ［2］ 。于屠宰场取回猪主动脉后，4h内在超净台上剥去其外膜，两端夹闭，D-Hank’s液冲洗干净后注入0.25%胰蛋白酶消化，37℃，5%CO 2 孵育12～15min后收取消化液，用10%FcS M199培养液中止反应，离心弃上清后用10%FcS M199培养液制成细胞悬液。计数后分装，平放置入培养箱内，定时换液传代。根据相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列，免疫荧光Ⅷ因子阳性鉴定为猪主动脉内皮细胞（pig Aortic endotheliac cell，PAEC）。
1.4 实验分组 采用生长稳定的第三代PAEC。用10%FcS（胎牛血清）M199培养液调整细胞浓度为5×10 6 /ml，以细胞数5×10 5 /孔接种于24孔塑料平底培养板，培养2～3天至细胞融合成片24h，D-Hank’s液洗1次，新鲜无血清M199培养液洗涤2次后加样。按以下步骤操作:
1.4.1 成血清和灭活血清对PAEC前列环素合成的影响 （1）空白对照组:加无血清M199液2ml/孔。（2）成人血清组加含25%HSM199液2ml/孔。（3）灭活血清组加含25%HIHS M1992ml/孔。每组8孔，37℃、5%CO 2 培养箱内孵育1hr后收集上清，离心1000rpm，10min。分装于冻存管内-30℃保存备测。
1.4.2 成人血清和新生儿血清对PAEC前列环素合成的影响 （1）正常对照组:加含10%FcS M199液2ml/孔;（2）成人血清组加含25%HSM199液2ml/孔。（3）新生儿血清组加含25%NSM199液2ml/孔。每组8孔，37℃、5%CO 2培养箱（SHEL-LAB1815TC型，日本）内孵育2h后收集上清。在相差显微镜下观察内及细胞形态和损伤情况。
1.5 培养上清检测指标 （1）6-keto-PGFI 2 （PGI 2 代谢产物）采用放免法测定，按药盒说明书操作。（2）LDH（乳酸脱氢酶）比色法测定，单位为U/100ml。采用721分光光度计（上海第三分析仪器厂）比色。所有实验数据以ˉx±s表示，采用t检验。
2 结果
2.1 三种不同组分人血清对PAEC前列环素合成的影响 见表1，与无血清M199培养液组比较，新鲜成人混合血清，灭活成人血清和新生儿血清均能刺激PAGE前列环素合成，分别增加12（P<0.01），18（P<0.001）和11（P<0.01）倍以上。以灭活补体成人血清组最高，但三组相互比较差异无显著性（P>0.05）。
2.2 三种人血清对PAEC前列环素合成的影响和损伤作用 见表2，与正常培养状态（用10%FcS M199培养液比较，新鲜成人混合血清刺激组PGI 2 合成减少（P<0.05），内皮LDH释放增加（P<0.01）。而灭活成人血清和新生儿血清刺激组前列环素合成量无明显改变（P>0.05），LDH释放量无明显增加（P>0.05）。
2.3 新鲜成人血清对PAEC前列环素合成不同时相作用比较 见表3，与正常培养状态比较，新鲜成人血清抑制PGI 2 合成，呈进行性下降趋势，2h后与对照组比较呈显著降低（P<0.05）。LDH释放量在1h时即达高峰（P<0.001），2h后稍有升高。
表1 三种不同成分血清对PGI 2 合成的影响（略）
注:compared with control， ˇˇ P<0.01， ˇˇˇ P<0.001
表2 三种人血清对PAEC合成和损伤的影响（略）
注:compared with10%FCSx group， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01NS:newborn sera，HS:Human serum HIHIS:heat-inactivated human sera
表3 新鲜成人血清对PAEC合成不同时相作用比较（略）
注:Compared with control（1）: ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01， ˇˇˇ P<0.001
3 讨论
同种器官移植被公认是许多终末期疾病的特效治疗方法。近年来由于供体器官来源日益减少和困难，研究人员开始重新考虑利用动物器官移植给人，即开始了异种移植（xenotransplantation）研究的热潮，早在1964年Reemtsma、starˉzl等成功地施行了灵长类动物黑猩猩、狒狒供肾的异种肾 移植，其中最长1例有功能存活达9个月 ［1］ ，Starzl在1992年施行2例狒狒对人异种肝移植，有功能存活70天和26天。异种移植可能是彻底解决供体器官紧缺危机的唯一方法。由于灵长类动物数量有限，可能传播某些病毒性疾病和存在许多伦理学争议，多数学者现倾向于采用非灵长类动物如猪作为今后临床异种移植的主要供体 ［1，5］ 。猪到人异种移植的首要障碍是超急性排斥反应，其主要病理特征是血管内皮损伤和血栓形成。Bach和Platt等根据大量研究结果推测超排病变均可归结为移植物血管内皮细胞激活 ［1］ 。正常静息状态血管细胞构成单层膜屏障，只有抗血栓功能。一旦激活和损伤则失去屏障功能并转为促凝状态 ［1］ ，表现为抗凝物质丧失，如血栓调节蛋白、激活的蛋白C、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）等和释放某些促凝物质;如组织因子（TF）、白介素1（IL-1）等而促进血栓形成。Platt等特别研究了人血清激活猪内皮细胞后硫酸乙酰肝素（heparin Sulfute）的变化。正常血管内皮上含有大量硫酸乙酰肝素，它能增强AF-Ⅱ作用而抑制血栓形成，增加SOD活性和保持血管壁完整性。Platt等发现人血清（内含天然抗体和补体）与单层猪主动脉内皮细胞反应后可导致内皮细胞迅速裂开和约50%内皮细胞表面的硫酸肝素的丢失。硫酸乙酰肝素的迅速丧失可能在异种移植血栓形成中起重要作用。前列环素（PGI 2 ）是一种重要的生理性抗血栓物质。主要来自血管内皮细胞。PGI 2 通过激活腺苷酸环化酶（AC）升高血小板环磷酸腺苷（cAMP），从而减少胞浆内游离钙浓度，抑制血小板粘附和聚积而起抗凝作用。内皮细胞PGI 2 合成减少在冠状动脉粥肝硬化血栓形成和心肌梗死等血栓性疾病中的作用已引起研究人员极大关注。对异种移植超排时内皮细胞PGI 2 合成功能变化尚未见报道。本研究即是为了探讨猪到人异种移植超排时PGI 2 可能变化和诱因，对防治血栓形成具有重要的理论和实践指导意义。
本研究表明，3种人血清在早期均可刺激PAEC大量合成前列环素（PGI 2 ），与无血清组比较升高11～18倍以上。可能是一种代偿反应以加强抗血栓能力。但由于PGI 2 强力舒张血管，在PGI 2 增加的局部可引起PAEC的通透性改变，引起血浆渗出，这对解释超排早期病变具有一定意义。与正常培养状态（10%FcS M199培养液）比较，新鲜成人血清可明显抑制PAEC前列环素合成，随刺激时间延长而呈进行性下降;并引起内皮DH释放量迅速升高，1h内即达高 峰，2h后未再明显上升。表明PAEC损伤以人血清刺激1h内为主。LDH是评价EC损伤的良好指标。相反，灭活成人血清和新生儿血清无类似损伤作用。分析三种血清活性组分，新鲜成人血清含IgM，IgG天然抗体和补体;灭活血清补体活性丧失，含IgM，IgG，新生儿血清，由于胎盘屏障作用，不含IgM，但IgG和补体水平与成人相近。与表2进行对比分析排除，提示只有含IgM和补体的成人血清方能导致PAEC前列环素合成减少和损伤，二者缺一不可，与Platt等有关结论相同。但近有Humt提出异议。他在人血体灌注猪心模型中观察到，去除抗猪抗体式耗竭补体后血栓形成仍然发生，他认为猪到人异种移植排斥中凝血系统激活可能不依赖天然抗体和补体，可能通过生理途径直接激活凝血组分，今后须对超排中凝血系统激活机制作进一步的研究，为指导临床防治超排提供更完善的理论依据。总之，人血清IgM型天然抗体和补体可明显抑制猪主动脉内皮细胞前列环素合成并造成损伤，PGI 2 合成减少可能是异种移植血栓形成过程中的重要环节。本实验模型的建立为今后体外模拟研究猪到人异种移植超排机制和筛选抗血栓和抗排斥药物提供了一个合理、实用的实验模型。
参考文献
1 Bach FH.Xenotransplantation:a view to the future Transplant Proc1993，25（1）:25.
2 Starzl TE，Murase N，Tzakis A，et al.clinical xenotransplantation Xenoˉtransplantation，1994，1:3.
3 Hancock WW，Buelow R，Sayegh MH，et al.Antibody-induced transˉplant arteriossis is prevented by graft expression of anti-oxidant and anti-apoptotic gens.Nature Medicine，1998，4:1392-1396.
4 邓凡.细胞的生长和增殖.见:罗深秋，主编.医细胞生物学.北京:军事医学科学出版社，1998，164-177.
5 PlattJL.Xenotransplantation，New risks，new gains（comment）（news）.Nature，2000:407:2729-2730.
（收稿日期:2004-06-01）
作者单位:430030武汉华中科技大学同济医院临床药学部研究室
同济医院器官移植研究所
（编辑海 天）