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【摘要】 目的 研究丹酚酸B镁盐对多种肿瘤细胞株体内、体外生长的抑制作用。 方法 体外用MTT法、体内用中空纤维法分别检测丹酚酸B镁盐对不同肿瘤细胞株在体外培养和裸鼠体内生长的抑制作用。 结果 体外MTT实验中，丹酚酸B镁盐对人肾癌（786-0）、小鼠乳腺癌（C127）、人乳腺癌（MCF-7）、人肝癌（Hep G2）、小鼠黑色素瘤（B16）、人胃癌（SGC-7901，AGS）、人食管癌（Eca-109）等细胞株的最大抑制率皆达到40%以上，其中对肝癌细胞株HepG2的最大抑制率可达到90%以上。中空纤维实验进一步证实丹酚酸B镁盐对于裸鼠体内生长的Hep G2细胞也具有较好的抑制率，其最大抑制率可达到30.11%。 结论 体内、体外实验表明丹酚酸B镁盐对多种肿瘤细胞株的生长具有较好的抑制作用。
关键词 丹酚酸B镁盐 MTT 中空纤维 抗肿瘤作用
Antitumor Effect of Salvianolic acid B
Zhu Hongli，Xie Tianpei，Gu Xinbin，et al.
Shanghai TenGen Biomedical Co.，Ltd.，Shanghai201203.
【Abstract】 Objective To examine the inhibitory effects of Salvianolic acid B（Sal B）on some tumor cell lines in vitro and in vivo.Methods MTT and hollow fiber assay were adopted in vitro and in vivo studies respective-ly to detect the effects of Sal B on the growth of different tumor cell lines.Results Results from in vitro MTT experi-ments showed that the growth inhibitory ratio of Sal B on the tested tumor cell lines（786-0，C127，MCF-7，B16，SGC-7901，AGS，Eca-109）reached above40%，and on Hep G2it reached above90%.Sal B also showed sig-nificant inhibitory effects on the growth of Hep G2cell in the nude mice in hollow fiber assay，the highest inhibitory ratio being30.11%.Conclusion Sal B has inhibitory effects on the growth of many tumor cell lines both in vitro and in vivo.
Key words salvianolic acid B MTT hollow fiber antitumor effect
丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）是由三分子丹参素和一分子咖啡因缩合而成，有文献报道其对个别肿瘤细胞株的生长具有抑制作用 ［1］ 。本研究采用MTT法和中空纤维法从体内、体外两方面对丹酚酸B的抗肿瘤作用进行进一步的探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 超净工作台（苏净集团生产）、二氧化碳培养箱（Thermo Forma）、倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）、酶标仪（上海雷勃分析仪器有限公司）。
1.1.2 药品与试剂 丹酚酸B镁盐由本公司提取，为灰绿色晶体，纯度>96%，PBS溶液配制;5-Fu（10ml:0.25g）由上海旭东海普药业有限公司生产;长春新碱（1mg/支）由上海华联制药有限公司生产;MTT购自Sigma公司;DMSO购自中国医药集团上海试剂公司;中空纤维购自美国Spec-trum laboratories，Inc.。
1.1.3 细胞株 所用细胞株均购自中国科学院上海细胞资源中心。
1.1.4 动物 BALB/CA-nu裸鼠，体重为20±2g，购自中国科学院上海实验动物中心，饲养于百级层流柜中。
1.2 方法
1.2.1 体外药效—MTT法 以PBS溶液为溶剂，将5-Fu、长春新碱和丹酚酸B镁盐配制成一系列浓度梯度的药液。
在确定给药体积为20μl的情况下，5-Fu和丹酚酸B镁盐的使用终浓度为25、50、100、200、400μg/ml ［2］ ，长春新碱的使用终浓度为2.5、5、10、20、40μg/ml。本实验中以5-Fu和长春新碱为阳性对照，以含10%PBS液的相应细胞完全培养液为阴性对照。将处于对数生长期的各种肿瘤细胞以5×10 4 /ml浓度接种于96孔板中，每孔200μl。24h后，板上各孔内分别换上含有相应浓度药物的细胞培养液，于37℃，5%CO 2 培养箱中培养;各种药物各浓度设6个平行孔。48h后，每孔中皆加入浓度为5mg/ml的MTT溶液20μl。继续温孵4h后，弃去96孔板上各孔中溶液，每孔再加入DM-SO200μl以溶解甲（formazan）沉淀。室温下放置0.5h后，用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光值。按下式计算细胞生长的抑制率:细胞生长抑制率（%）=（对照组吸光值-实验组吸光值）/（对照组吸光值）×100%，并用回归法求半数抑制浓度（IC 50 ）。
1.2.2 体内药效—中空纤维法 本研究将人肝癌细胞（Hep G2）以1×10 7 /ml的浓度装入中空纤维管中，制成若干个2cm长的中空纤维标本，分别接种到裸鼠体内，每鼠皮下及腹腔各种入1根中空纤维标本管。于接种后第2天给裸鼠腹腔注射给药，每天1次，连续5天。丹酚酸B给药组和阳性药对照组各3只裸鼠，阴性对照组6只裸鼠。丹酚酸B镁盐的给药剂量为12.5mg/kg，阳性药5-Fu的给药剂量为91mg/kg，阴性对照组裸鼠给予PBS溶液。给药结束次日将裸鼠称重后处死，从其体内取出中空纤维标本管并收集其内肿瘤细胞进行MTT检测。根据检测结果计算各种药物对Hep G2肿瘤细胞的抑制率。计算公式为:细胞生长抑制率%=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值×100%。另对裸鼠给药前后体重的变化进行观察，对处死后裸鼠体内各脏器进行肉眼尸检。
1.3 统计学处理 体外MTT实验和体内中空纤维测定实验中吸光度各组均数皆与阴性对照组均数数据进行t检验比较;各组裸鼠实验前后体重的变化进行t检验配对比较。
2 结果
2.1 体外药效 体外MTT法实验结果表明，除SHZ-88外，丹酚酸B对所试细胞株皆有抑制生长的作用;丹酚酸B对786-0、C127、MCF-7、Hep G2、B16、AGS、Eca-109等细胞株具有较好的抑制作用，最大抑制率均为40%以上;所试细胞株中，Hep G2细胞对丹酚酸B最为敏感，当丹酚酸B终浓度为200μg/ml，持续作用48h后，对该细胞活性的抑制率可达90%以上。SHZ-88细胞对丹酚酸B最不敏感，当丹酚酸B终浓度为400μg/ml，持续作用48h后，该细胞的生长仍未受到抑制（见Table1）。丹酚酸B对Hep G2、B16、Eca-109三种肿瘤细胞的IC 50 值分别为50.21μg/ml，227.56μg/ml和200.96μg/ml。
2.2 体内药效 本研究以中空纤维法同时考察了丹酚酸B和5-Fu对埋植于裸鼠腹腔和皮下的Hep G2细胞的生长抑制作用。对于皮下埋植的Hep G2细胞而言，5-Fu和丹酚酸B对其活性皆具有显著的抑制作用（P<0.01）;实验结束时5-Fu给药组和丹酚酸B给药组对Hep G2细胞活性的抑制率分别达到30.81%和30.11%。对于腹腔埋植的Hep G2而言，5-Fu和Sal B对其活性皆具有明显的抑制作用，但丹酚酸B的抑制作用要强于阳性对照药5-Fu;实验结束时5-Fu给药组和Sal B给药组对Hep G2细胞活性的抑制率分别达到15.50%和26.64%（见Table2）。
Table1 The inhibitory effects of Sal B，5-Fu and Vincristine on the growth of different tumor cell lines略
Table2 The inhibitory effects of Sal B and5-Fu on the growth of Hep G2cell and the body weight of nude mice in hollow fiber assay Groups n Dosage （略）
2.3 实验前后各组动物体重变化 阴性对照组和丹酚酸B治疗组裸鼠实验后体重比实验前略有下降，而5-Fu治疗组裸鼠实验后的体重比实验前显著下降（P<0.05）（见Table2）。肉眼尸检未发现各组裸鼠出现肉眼可见的脏器变化。
3 讨论
丹酚酸是丹参中重要的一类水溶性有效成分。有文献报道丹酚酸中含量最高、活性最强的成分丹酚酸A与B具有抗肿瘤作用 ［1，3］ 。丹酚酸B在5～80μg/ml浓度范围内对HL-60细胞生长和增殖有抑制作用，并呈明显的剂量依赖关系 ［1］ 。本研究结果进一步表明，丹酚酸B在25～400μg/ml浓度范围内对多种肿瘤细胞株的生长和增殖有抑制作用，并呈明显的剂量依赖关系。
肝炎、肝纤维化、肝癌发病机制复杂，文献报道丹酚酸B对CCl 4 熏蒸和D-半乳糖胺直接造成的大鼠肝细胞损伤具有明显的保护作用 ［4，5］ ，证实丹酚酸B具有抗肝损伤和肝纤维化的作用;但对其是否具有治疗肝癌的作用尚未见报道。本研究在体外MTT实验中发现丹酚酸B对人肝癌细胞（Hep G2）具有很好的生长抑制作用后，又进一步进行了体内中空纤维实验，结果表明丹酚酸B对裸鼠体内埋植的人肝癌细胞（Hep G2）也具有一定的生长抑制作用，其抑制率达30%左右。提示丹酚酸B可能会对肝癌具有一定的治疗作用。
中空纤维测定法是近十年来兴起的一种抗肿瘤药体内药效筛选方法，已被美国国立肿瘤研究所（NCI）确定为抗肿瘤药体内筛选常规方法，也是我国鼓励使用的一种抗肿瘤药体内筛选方法。中空纤维法又称纤维管接种法（Hollow Fiber Assay，Hollow Fiber Tumor Model），是将一定数量的某种肿瘤细胞装入中空纤维管，制成一定长度的标本，再将此标本用手术接种到裸鼠体内。然后给予受试药物，治疗结束后取出中空纤维标本，用MTT法检测其中的肿瘤细胞活性，以了解药物在体内抗肿瘤作用的一种实验方法 ［6，7］ 。作为肿瘤细胞的载体，中空纤维管是用一种氟化聚乙烯材料（PVDF）制成，该种材料具有半透膜性质，其一方面可将肿瘤细胞网于管中，使其不至于外溢;另一方面又不影响动物体液内物质（蛋白及分子量大于500KD的物质除外）进入中空纤维管与其内肿瘤细胞作用。另外，与常规的抗肿瘤药物动物体内药效学实验相比，中空纤维模型在提供了体内全真环境的同时，还具有以下一些优点:可同时在一只裸鼠体内放置3～4种肿瘤细胞，进行皮下和腹腔接种，且在较短给药时间后（通常给药4～5天）即可看到药物对肿瘤细胞的作用;所以与一般肿瘤模型相比而言，中空纤维实验是一种更适用于实际使用的低成本、高通量的抗肿瘤药物体内药效学筛选模型，适合进行较大规模的抗肿瘤药体内药效学筛选。本研究中空纤维测定法结果与体外MTT检测法所得结果的一致性，进一步证实中空纤维测定法用于抗肿瘤药物体内筛选的可靠性。
参考文献
1 侯敢，黄迪南，祝其峰.三种天然抗氧化剂对早幼粒白血病细胞（HL-60）的生长抑制作用研究.湖南中医学院学报，1996，16（1）:49.
2 彭勤，骆云鹏.MTT比色法测定药物对HeLa细胞作用的实验研究.现代妇产科进展，2000，9（5）:341-343.
3 甄永苏.丹酚酸A用于治疗肿瘤新用途.沈阳医药，1997，12（1）:41.
4 刘平，刘乃明，徐列明，等.丹酚酸乙对四氯化碳体外损伤原代培养大鼠肝细胞的直接保护作用.中国中药杂志，1997，22（5）:303-305.
5 刘平，森泽成司.丹酚酸B镁盐抗大鼠D-半乳糖胺肝损伤的作用.中国中西医结合杂志，1993，13（6）:352-353.
6 Hollingshead MG，AlleyMC，Camalier RF，et al.In vivo cultivation of tumor cells in hollow fibers.Life Sci，1995，57（2）:131-141.
7 Hall LA，Krauthauser CM，Wexler RS，et al.The hollow fiber assay.Methods Mol Med，2003，74:545-566.
作者单位:201203上海天甲生物医药有限公司
（收稿日期:2004-09-12） （编辑青 山）