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【摘要】 目的 研究肾上腺素对体外培养的皮肤瘢痕成纤维细胞凋亡的影响。方法实验采用Giemsa染色、流式细胞仪及基因组DNA电泳检测肾上腺素作用24h后诱导的成纤维细胞凋亡。结果 0.05、0.10、0.20μmol/L的肾上腺素作用24h，瘢痕成纤维细胞凋亡率依次为12.3%、18.4%和36.7%。与对照组比较，差异有显著性。肾上腺素作用24h后，可使瘢痕成纤维细胞的胞核、胞质浓缩，染色质边集，细胞突出变短、变少，1.5%琼脂糖电泳结果出现DNA梯子，并呈剂量依赖性。结论 在瘢痕成纤维细胞生长融合后早期（24h），肾上腺素可诱导体外培养的瘢痕成纤维细胞凋亡。
关键词 瘢痕 成纤维细胞 肾上腺素 凋亡
The influence of adrenaline on the scar fibroblasts apoptosis
Zhang Chengde，Tian Ying，Song Lan，et al.
Department of Burns and Plastic Surgery，The First People’s Hospital of Changde city，Chang de415000.
【Abstract】 Objective To investigate the influence of adrenaline on the hypertrophic scar fibroblasts apoptoˉsis.Methods Human normal and hypertrophic scar dermal fibroblasts were propagated in aserum-free in vitro model with adrenaline exposure to for24hours.Cell apoptosis was determined by Giemsa staining，flow cytometer and1.5%agarose gel electrophoresis.Results In our study，adrenaline induced apoptotic DNA break in a concentration-deˉpendents manner and cell apoptotic percentage induced by0.05、0.10and0.20μmol/L adrenaline was12.3%，18.4%and36.7%，respectively.On the same time，after modulation of hypertrophic scar fibroblasts for24hours with aˉdrenaline，fibroblasts take on distinct morphological changes，including nuclear condenstation and digestion，membrane blebbing，and formation of apoptotic bodies.Conclusion We conclude from these results that adrenaline can induces the apoptosis of the hypertrophic scar fibroblasts.
Key words scar fibroblast adrenaline apoptosis
创伤愈合是机体遭受外力作用，皮肤等组织出现离断或缺损后各种组织的再生及肉芽组织形成瘢痕的复杂过程，瘢痕形成则是组织创伤修复的必然的产物。然而瘢痕组织的形成对机体也有不利的一面，发生于体表的瘢痕增生过度影响形体的美观，给患者带来精神上的痛苦。当前增生性瘢痕的治疗往往效果欠佳，寻求理想的治疗方案一直是医疗工作者努力的对象。我们观察了肾上腺素对体外培养的病理性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响，旨在为瘢痕防治提供科学的实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 DMEM培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（德国Merk公司）。Giemsa（Sigma Inc.USA），Proteinase K（Sigma Inc.USA），Agarose（Spanish分装），流式细胞双参数检测凋亡试剂盒（ANNEXIN V-FITC kit，Coulter Company）。
1.2 皮肤成纤维细胞的原代培养 采用 ［1］ 文献及细胞培养教材提供的皮肤成纤维细胞原代培养方法，取手术切除的增生性瘢痕组织，除去皮下组织，用D-Hanks缓冲液洗涤2～3次，剪成1mm 3 大小的组织块，接种于涂有胎牛血清的培养瓶中，37℃、5%CO 2 的培养箱中培养6h后，缓慢加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO 2 的培养箱中继续培养，3～5天后，取出漂浮的组织块，更换新鲜培养液（1次/3天），待原代培养的成纤维细胞满壁后，0.25%胰蛋白酶消化传代，实验选用第3～8代细胞。
1.3 形态学检测细胞凋亡 取对数生长期增生性瘢痕成纤维细胞，0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清DMEM培养液调整细胞浓度，以0.5×10 5 个/ml接种于24孔平底培养板中，37℃、5%CO 2 的培养箱中孵育，3天后，更换为无血清培养液，加入0、0.05、0.10、0.20μmol/L肾上腺素，每组3个复孔。处理24h后，弃上清，采用文献 ［2］ 提供的Giemsa染色疗法，加甲醇固定20min，Giemsa工作液染色18min，流水冲洗，干燥。图象分析系统拍摄图片。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期增生性瘢痕成纤维细胞，以40×10 4 接种25cm 2 培养瓶中，含10%胎牛血清DMEM培养液培养3天后，更换为无血清培养液，加肾上腺素0、0.05、0.10、0.20μmol/L处理24h，培养细胞去培养液，用0.01mol/L PBS洗2次，0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，去胰蛋白酶，细胞再用PBS洗2次，用稀释缓冲液重悬细胞，调节细胞悬液浓度为1×10 6 /ml。取195μl细胞悬液，加入5μl Annexin V-FITC混合，室温下反应10min，以1000r/min离心5min，去上清液，沉淀细胞用PBS洗1次，再次离心，沉淀细胞重悬于190μl稀释缓冲液中，加入10μl碘化丙啶（20μg/ml），反应10min后，流式细胞仪检测凋亡。
1.5 凋亡NDA片段的检测 取对数生长期增生性瘢痕成纤维细胞，以40×10 4 接种25cm 2 培养瓶中，含10%胎牛血清DMEM培养液培养3天后，更换为无血清培养液，加肾上腺素0、0.05、0.10、0.20μmol/L处理24h后，收集各处理组细胞分别于1.5ml离心管中，1000r/min离心5min弃上清，用预冷的PBS（pH7.4）1.0ml冲洗，1000r/min离心5min弃上清，每组加入裂解液300μl，混匀37℃水浴24h。加125μl平衡酚，混匀10000r/min室温离心10min，转移上清于新离心管中重复上步。转移上清于新离心管中，加chloroform:Isoamyl Alcohol（24:1）125μl，混匀10000r/min室温离心10min。转移上清于新离心管中，加3mol/L Sodium Acetate（pH5.2）25μl及2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀-20℃放置1h，10000r/min室温离心10min。弃上清，用70%预冷乙醇冲洗，50000r/min室温离心10min，空气干燥20min。加含20μg/ml Rnase A的TE30μl溶解DNA，各处理组取10μl进行1.5%（含B0.5μg/ml）琼脂糖电泳，凝胶成像系统下观察DNA条带并拍照。
1.6 统计学分析 数据以ˉx±s表示，采用SPSS10.0软件建立数据库，实验数据进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 肾上腺素作用24h瘢痕成纤维细胞的形态特征 肾上腺素作用于体外培养的增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞24h，Giemsa染色，无药物处理组，细胞形态规则，胞核呈椭圆或圆型，胞体呈梭形，见正常的细胞突出。肾上腺素处理组细胞质及胞核出现不同程度浓缩，胞核形态不规则，细胞突出变短或缺失。见图1。
2.2 肾上腺素作用24h流式检测细胞凋亡 利用流式细胞仪对肾上腺素0.05、0.10、0.20μmol/L三种浓度诱导的瘢痕成纤维细胞凋亡率分别进行了检测，结果见图2、表1。B1区:死亡细胞;B2区:晚期凋亡细胞;B3区:存活细胞;B4区:早期凋亡细胞。
表1 瘢痕成纤维细胞凋亡的流式细胞仪检测结果（略）
2.3 肾上腺素作用24h DNA琼脂糖凝胶电泳 0.05μmol/L肾上腺素作用于瘢痕成纤维细胞24h后，即出现凋亡细胞特有的梯形条带（见图3）。
3 结论
增生性瘢痕是组织损伤后修复过度的一种改变，表现为成纤维细胞的大量增生以及胶原等间质蛋白的沉积，是临床常见的难治病症，其发病机制尚不十分清楚。目前认 为，多细胞生物的死亡有两种机制，即凋亡和坏死。凋亡是受有关基因调控的一种程序性细胞死亡。在形态学上，细胞凋亡的特征为胞膜、核膜保持完整，核染色质边集、浓缩，细胞表面出泡，最终脱落形成膜包裹的凋亡小体等。细胞凋亡最突出的生化改变是Ca 2+ /Mg 2+ 依赖性核酸内切酶的活化，使DNA发生核小体间的断裂，结果产生含有不同数量核小体单位的片段，在琼脂糖凝胶电泳时，产生特征性的梯形条带“DNA ladders”，其大小为180～200bp或其整数倍。最近研究发现 ［2］ 创伤瘢痕形成过程中存在成纤维细胞凋亡，而细胞凋亡的减少和增生可能与瘢痕形成及消退相关。Ladin等 ［3］ 研究发现，瘢痕疙瘩和培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中Bcl-2蛋白表达升高，并伴有细胞凋亡率的降低。后来，Messadi ［4］ 等研究发现，与瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕成纤维细胞相比，正常皮肤成纤维细胞的凋亡率是前者两倍多，近来的研究发现 ［4］ 凋亡参与了创伤愈合过程中从肉芽组织到瘢痕组织的过渡，凋亡的减少在病理性创伤愈合中扮演着重要的角色。
本实验组前期研究发现 ［5］ ，肾上腺素可抑制体外培养的瘢痕成纤维细胞的增殖，并观察到细胞形态随肾上腺素作用浓度的增加，胞核胞质浓缩，细胞突出变少、变短。现今，我们的Giemsa染色实验结果表明，在细胞融合后早期（24h），随肾上腺素作用浓度的增加，瘢痕成纤维细胞形态突出变少、变短，胞核胞质浓缩，染色质向核膜边集。流式细胞双参数凋亡检测结果，0.05、0.10、0.20μmol/L的肾上腺素作用24h，瘢痕成纤维细胞凋亡率依次为12.3%、18.4%和36.7%;与无药物处理组比较，其差异有显著性（P<0.01）。0.05μmol/L肾上腺素作用于瘢痕成纤维细胞24h后，即出现凋亡细胞特有的梯形条带，随作用药物剂量的增加，DNA断裂程度增高，梯形条带越明显，呈现明显的剂量依赖性。我们的实验结果表明肾上腺素可促进体外培养的瘢痕成纤维细胞凋亡，通过促进凋亡途径抑制体外培养的瘢痕成纤维细胞的增殖，其作用的分子机制还待深入研究。 （本文图片略）
参考文献
1 宋维铭，孙广慈，管正玉，等.正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞培养、生物学特征及超微结构的比较研究.中华烧伤杂志，1998，14（6）:410-413.
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5 张彩平，张承德，宋岚，等.肾上腺素对瘢痕成纤维细胞增殖的影响.中华实用医药杂志，2004，4（4）:289.
基金项目:湖南省科技厅资助课题（00SSY1013-13）
作者单位:1 415000湖南省常德市第一人民医院烧伤科
2 南华大学生物化学与分子生物学教研室
（收稿日期:2004-08-22） （编辑日 强）