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RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象广泛存在于生物界，从低等的原核生物到人类均已有发现。将与靶基因的转录产物mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）导入细胞，可以使该mRNA降解，导致靶基因沉默。这种转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）被称为RNA干扰。RNA干扰的研究发展迅猛，下面对其最新进展做一综述。
1 RNA干扰名称的由来
1990年，Napoli等为了加深矮牵牛花的紫色，添加过量的合成色素的基因拷贝入细胞，结果事与愿违，不仅转入的基因未表达，而且自身的色素合成也减弱了，转基因的花出现了白色或全白色，当时他们把该现象称作共抑制（co-suppression） ［1］ 。
1995年，康乃尔大学的Guo和Kemphues发现正义RNA与反义RNA同样能阻断线虫中par-1基因的表达，但他们不得其解 ［2］ 。
直到3年后，即1998年，Fire等 ［3］ 首次将双链RNA导入线虫（Caenorhabditis elegans）研究基因沉默机制，发现双链RNA较正义和反义RNA更能高效地特异性阻断相应基因的表达，他们称这种现象为RNA干扰，才揭开了研究双链RNA介导特异性基因沉默机制的序幕并从此蓬勃发展起来。
2 RNA干扰的分子机制及特点
目前RNA干扰的分子机制还未彻底弄清，但比较公认的机制模型为:外源性或内源性的双链RNA与RnaseⅢ家族的核酸酶Dicer结合，随即被后者切割成长约21～23nt的siRNA（small or short interference RNA），其具5'单磷酸和3'羟基末端，且互补双链的3'端均有2nt的单链突出（通常是尿嘧啶核苷酸）。siRNA形成之后与一系列特异性蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。研究发现RISC具有解螺旋酶、核酸酶（可能与Dicer类似）的功能，在果蝇、线虫中还有RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）功能等 ［4］ 。siR-NA作为引导序列，按照碱基互补配对原则识别靶基因转录的mRNA，并引导RISC结合mRNA，随后通过依赖于ATP的解螺旋酶解开siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置换，即mRNA取代正义链与反义链互补，继而核酸酶将mR-NA切割成21～23nt的小片段，切断部位大约在与siRNA反义链配对序列的中部，而后mRNA进一步降解;另一方面，RISC中的RdRP以siRNA反义链作为引物，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，然后由Dicer切割产生新的siRNA，新siRNA再去识别新mRNA，又产生新的siRNA，经过若干次合成-切割循环，沉默信号不断放大 ［5］ ，甚至穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持 ［3，6］ 。
RNA干扰的特点有:①降解靶mRNA的中介分子为21～23nt的dsRNA;②序列特异性:一方面是指只有针对靶基因编码区的dsRNA才能产生RNA干扰，而针对靶基因内含子或启动子区域的dsRNA不能产生RNA干扰，另一方面是指siRNA与靶mRNA的结合严格遵循碱基配对规律，siRNA除3'末端两个尿嘧啶碱基不起识别作用外，序列中的任何一个碱基改变都可导致RNA干扰作用减弱，甚至完全失效 ［7］ 。③高稳定性:由于dsRNA3'端突出u碱基而使其不易被细胞内核酸酶类降解;④可传递性:RNAi抑制基因表达的效应可在生物体内的不同细胞之间传递和维持，在线虫中干涉效应甚至可通过生殖系传递到后代中去 ［4］ ;⑤高效性:相对于反义RNA而言，RNAi抑制靶基因的特异性和效率均较之高10倍以上 ［8］ ;⑥时间剂量依赖性:在一定范围内与dsRNA剂量成正比，而与作用时间成反比;⑦双干扰系统:非特异性干扰反应由大于30bp的dsRNA介导，导致整个细胞非特异性蛋白合成抑制及RNA降解;特异性干扰反应由21～23nt的siRNA介导，特异性地降解相应基因的mRNA;⑧需要ATP参与其效应 ［9，10］ 。
3 RNA干扰的生理功能
3.1 抗病毒 很早就发现PTGS与TGS和植物的抵抗病毒感染有关 ［11］ ，病毒作为外源核酸进入生物体后，会产生dsRNA复制中间体，这种dsRNA可以诱导生物体产生特异性的PTGS以及非特异性的干扰素等的抗病毒宿主反应。在果蝇细胞中，Flock house virus（FHV）能引发果蝇内部的RNAi反应，产生FHV特异性的siRNA降解FHV ［12］ 。在哺乳动物细胞中发现病毒感染后识别dsRNA的蛋白质如PKR、2′，5′-寡核苷酸聚合酶大量合成，从而激发干扰素诱导的抗病毒状态 ［6］ 。
3.2 抑制转座子 转座子的一个重要特征是具有反向重复序列，可以通过“延续转录”产生发夹RNA，引起PTGS反应，导致转座mRNA降解，阻止转座酶的生成，从而抑制转座子的移动，保持遗传稳定，防止遗传损害 ［13］ 。1999年，Tabara等 ［13，14］ 在研究线虫RNAi缺陷的突变株时发现，一些RNAi缺陷的突变株表现出内源性的转座子运动增加;多种模式生物研究表明，剔除了RNAi相关的基因，则导致异常的转座子运动 ［15］ 。这些都提示RNAi有抑制转座子的功能。
3.3 参与基因调控 DNA甲基化后，基因就会失去转录活性，导致沉默，而且这种甲基化状态可以传给子代，使该基因在子代中表达仍然受到抑制 ［16］ 。1994年，Wassenegger等 ［16］ 在植物中发现染色体DNA甲基化依赖于双链RNA的存在。后来他与Pelissier ［17］ 又证实病毒在细胞内复制所形成的双链RNA可使宿主染色体上长约30bp的同源序列甲基化，并发现只要存在序列同源性，双链RNA即可使基因发生甲基化，从而调控基因表达。近来，在生物界发现了大量的微小RNAs（micro RNA sequence，miRNAs），大小在22核苷酸左右，它们是由Dicer酶从前体分子上切割而来，通过和靶基因mRNA的3′末端非翻译区结合而阻断相应蛋白质的翻译，如线虫的line4和let7。另外，RNAi途径中的RdRP可以识别过量的或异常的mRNA，从而启动RNAi，来抑制相应基因的表达 ［18］ 。
3.4 改变染色质结构 Volpe等 ［19］ 发现整合至裂殖酵母（S.pombe）着丝粒区的转基因表达总是被抑制，他们称此现象为“着丝粒沉默”（centromeric silencing），后来发现着丝粒沉默是由于此区域核小体组蛋白H3的Lys9甲基化后引起染色质凝集所致，并证明与RNAi相关的基因突变可使组蛋白H3甲基化消失，同时使着丝粒沉默现象消除。与此同时Reinhart等 ［20］ 从裂殖酵母中分离出了一种与着丝粒区序列同源的小RNA分子，这些结果表明一些内源性的siRNA能够改变染色质结构。
3.5 参与生长发育 有许多基因沉默缺失突变体表现为生长发育不正常，在线虫中，基因沉默必需基因AGO1突变产生神经突发育缺失;AGO2和Dicer以及siRNA组成RISC;Piwi是干细胞保持增生所必需;sting缺失突变会导致雄性不育 ［21］ ;ego1和mut-7分别是生殖细胞发育和生殖细胞保持活性所必需 ［6，13，22］ 。在拟南芥中，突变体ago1的叶子形态不正常，caf的花细胞分裂不正常 ［13］ 。
4 RNA干扰的应用
4.1 研究基因功能 可以利用RNA干扰技术对目标基因进行特异性地表达沉默，通过观察其表达被抑制后细胞乃至生物体从形态到各项生理生化的变化来推导该基因的功能。Andrew等 ［23］ 用可分泌dsRNA的细菌喂养线虫，研究了染色体Ⅰ约90%的预测基因，13.9%的基因与其功能对应起来，使已知表型的基因数目由70增至378;袁婺洲等 ［24］ 分别将果蝇心脏发育基因tinman和wingless的dsRNA注入果蝇的早期胚胎，得到了这两个基因的dsRNA干扰表型，与两个基因的突变体表型非常相似，都表现为果蝇心脏前体细胞不能形成或心脏管缺失，尤其是tinman基因的dsR-NA，还引起了肠中胚层缺失和体壁肌肉组织的紊乱，而wingless基因的dsRNA却只影响心脏的形成，而不影响肠中胚层，说明dsRNA干扰具有非常强的特异性。目前通过RNAi已搞清楚了包括果蝇、线虫和一些植物的基因的功能。在哺乳动物基因功能研究方面，Tuschl实验组将体外构建的siRNA分别导入Hela细胞（人类宫颈癌细胞）、大鼠成纤维细胞和小鼠3T3细胞，分别抑制了lamin B1，lamin B2，NUP153，GAS41，ARC21，cdk1，β-actin和γ-actin等21个不同类型基因，均获得成功，并重新界定了部分必需基因和非必需基因 ［25］ 等等。
4.2 用于基因治疗 目前，已有研究证明在培养的哺乳动物细胞中，RNAi可用于抗病毒和抗肿瘤等的基因治疗。Wilda等用对M-BCR/ABL融合基因特异的siRNA转染白血病细胞K562，发现K562细胞中相应的mRNA被清除，并出现强烈的细胞凋亡现象 ［26］ 。Gitlin等报道了将特异性siRNA提供给培养的人和鼠细胞，发现siRNA象药物一样能进入细胞并有效地抗脊髓灰质炎病毒的感染 ［27］ ，还有人应用siRNA成功抑制了呼吸道合胞病毒（RSV） ［28］ 、乙肝病毒（HBV） ［29］ 、丙肝病毒（HCV） ［30］ 基因的表达。针对人类免疫缺陷病毒（HIV），Novina等 ［31］ 实验表明，合成的siRNA可特异性地沉默HIV-1细胞受体CD4，病毒结构蛋白Gag和 调节蛋白Nef，HIV-1复制周期的每一个环节都可以受到siRNA的有效抑制 ［32］ 。美国加州理工学院Baltimore实验室的研究人员以CCR5（CCR5是内源性人受体蛋白，主要的HIV-1受体）为RNAi的目标，用siRNA转染外周血T细胞，发现CCR5表达量减少约10倍，从而使感染细胞数减少6倍以上 ［33］ 。
4.3 用于药物筛选 Lavery KS认为RNAi技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具。他在其文章中具体描述了怎样在药筛的各个阶段应用RNAi ［34］ 。美国Genetica公司已将RNAi技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具。比利时Devgen公司也已建立了一个覆盖全基因组的线虫RNAi文库，只需通过喂饲含该文库的食物就可以观察到线虫表型的改变，这大大方便了药物靶标的识别和确认工作 ［33］ 。
4.4 研究信号传导通路 Clemensy等联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径，结果与已知胰岛素信息传导通路完全一致，他们还同时分析了DSH3PX1与DACK之间的关系，证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶。RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点，它必将成为研究细胞信号传导通路的新方法 ［35，36］ 。
5 展望
对RNAi的不断深入了解以及相应试剂盒的问世，为利用RNAi技术进行各项研究奠定了基础，可以预测，RNAi技术将为人类研究基因功能、对癌症、艾滋病、遗传性疾病等进行基因治疗等提供强大的武器。但还需进一步探索:①不同种生物是否沿用同一种RNAi机制?②RNAi机制本身受到哪些调控?③怎样才能设计出有效的siRNA，减少筛选有效序列的工作量?④作为药物，如何应用于临床?等等。
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作者单位:650031昆明医学院第一附属医院临床实验研究中心
（收稿日期:2004-08-26） （编辑一 坤）