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【摘要】 蛋白质芯片是近年来发展起来的新的生物检测技术，本文综述了该技术的发展情况及从其分类、构成到应用，并重点介绍了SELDI-TOF-MS这一技术。最后阐述了蛋白质芯片的前景及存在不足。
【关键词】 蛋白质芯片 SELDI-TOF-MS 生物检测技术
人类基因组计划已经进入后基因组时代（post genome era）—功能基因组时代，而作为基因功能的直接体现者-蛋白质及其之间的相互作用越来越引起科学家们的关注，因为要彻底了解生命的本质，就必须要了解蛋白质在生物生长、发育、衰老整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及它们与发生、发展和转化的规律，从而诞生了一门新的学科———蛋白质组学 ［1］ （Proteomics）。蛋白质芯片技术则是继基因芯片之后发展起来的生物检验技术，它高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点成为研究蛋白质组学的有力工具。它的出现对于生物学、临床检验医学、遗传学、药理学等很多学科的进步具有很大的意义。
1 蛋白质芯片的分类及基本构成
1.1 蛋白质芯片的分类 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，属于生物芯片的一种，根据制作方法和应用的不同将蛋白质芯片分为两种:一种是蛋白质检测芯片，类似于较早出现的基因芯片，即在固相支持物表面高度密集排列的探针蛋白点阵，当待测靶蛋白与其反应时，可特异性的捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测系统进行分析，如表面增强激光解析离子化—飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）将靶蛋白离子化，直接对其进行定性、定量分析 ［2］ ;第二种是蛋白质功能芯片，本质说就是微行化凝胶电泳板，即样品中的待测蛋白在电场作用下通过芯片上的微孔道进行分离，然后经喷射进入质谱仪中来检测待测蛋白质 ［3］ 。目前应用较多的是第一种芯片。
1.2 探针蛋白的制备 蛋白质检测芯片上的探针蛋白可根据研究目的的不同，选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性的蛋白质。由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白，用其构筑的芯片可用于检测蛋白质表达丰度及确定新的蛋白质。基因工程抗体的发展使蛋白质芯片的提出和发展成为可能 ［4］ 。噬菌体抗体库技术就是典型的代表。也可以利用其它的蛋白质文库制备探针蛋白，如全合成人重组抗体库、噬菌体肽库、噬菌体表达文库等。经蛋白质组技术如双相凝胶电泳技术分离得到的蛋白质作为抗原，把固相化的抗原与抗体库孵育，即可得到相应的单克隆抗体。
1.3 芯片的制备 因为蛋白质要比DNA难合成，更难于在固相支持物表面合成，所以蛋白质芯片要比DNA芯片复杂的多，芯片制作过程中保持蛋白质的生物活性成为一大难题。Ciphergen Biosystems公司是世界上较早发展蛋白质芯片的公司，并提出化学和生物化学蛋白质芯片两种类型 ［5］ 。化学型蛋白质芯片的构想来源于经典色谱（反相层析、离子交换层析、金属螯合层析等）的介质，分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属螯合芯片等五种。铺有相关介质的蛋白质芯片可以通过介质的疏水力、静电力、共价键等结合样品中的蛋白质，然后经特定的洗脱液去除杂质蛋白质，而保留目的蛋白质。这种芯片特异性较差。生物化学型蛋白质芯片则是把生物活性分子（如抗体、受体、配体等）结合到芯片表面，用于捕获样品中的靶蛋白。由于生物化学型蛋白质芯片具有高度的特异性及生物活性分子的多样性，其应用范围和应用前景都明显优于化学型蛋白质芯片。但目前该公司所生产和推广的蛋白质芯片大多数还局限化学型芯片上。Uetz等 ［6］ 使用酵母双杂交系统构筑了蛋白质芯片。Arenkov等 ［7］ 曾将探针蛋白质固定于聚丙烯酰胺凝胶中，待测样品通过电泳与凝胶中的探针蛋白发生特异性结合，从而捕获感兴趣的靶蛋白。Macbeath等 ［8］ 根据DNA微陈列原理设计出了蛋白质微阵列。
1.4 蛋白质芯片的检测 目前，对吸附到蛋白质芯片表面的靶蛋白的检测主要有两种方式。一种是以质谱技术的基础的直接检测法，Ciphergen Biosystems公司采用表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS），用激光解析电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来，具体过程为:芯片经室温干燥后，加能量吸附因子（energy absorb molecule，EMA）如芥子酸（spa），使其与蛋白质结成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解析附和离子化，利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解析形成荷电离子，根据不同质荷比离子在仪器场中飞行的时间长短不一，通过飞行时间质谱来精确地测定出蛋白质的质量，并由此绘制出一张质谱来，以分析蛋白质的分子量和相对含量 ［5］ 。另外一种为蛋白质标记法，样品中的蛋白质预先用荧光物质或同位素等标记，结合到芯片上的蛋白质就会发出特定的型号，用CCD（charge2coupled device）照相技术及激光扫描系统等对信号进行检测。从定量及简便角度来讲该方法要优于前一种。与DNA芯片一样，蛋白质芯片同样蕴涵着丰富的信息量，必须利用专门的计算机软件包进行图像分析、结果定量和解释。
2 蛋白质芯片的应用
2.1 蛋白质之间的相互作用 近年来，研究蛋白质相互作用的主要方法是酵母双杂交系统技术，该系统是在真核模式生物酵母中进行的，即当把靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于已知基因的启动子能启动报告基因在酵母细胞内的表达，通过检测该基因表达产物而判别诱饵蛋白和靶蛋白之间是否存在相互作用 ［9］ 。该技术是体内方法，易于操作实施并且应用范围广，但存在着许多局限性，如假阴性和假阳性 ［10］ ，酵母体内表达的外源蛋白质不能正确折叠，蛋白质翻译后修饰及表达过程的条件（离子浓度、存在或缺失辅助因子、温度等）难以控制等。蛋白质芯片技术由于是在体外条件下进行操作，并直接检测目标蛋白质，不需要酵母作为中介，突破了酵母双杂交系统技术的局限性，必将成为研究蛋白质相互作用的理想工作。
2.2 蛋白质芯片在临床诊断方面的应用 蛋白质芯片能够同时检测生物样品中与某种疾病或环境因素损伤可能相关的全部蛋白质的含量变化情况，即表型指纹（phenomi-cifingerprint）。对于疾病的诊断或筛查来讲，表型指纹要比单一标志物准确可靠得多。蛋白质芯片的探针蛋白的特异性高、亲和力强，受其它杂质的影响较低，因此对生物样品的要求较低，简化了样品的前处理，甚至可以直接利用生物材料（血样、尿样、细胞及组织等）进行检测。由于蛋白质芯片的高通量性质，加快了生物标志物发现和确认的速度。很多文献报道了大量关于利用Ciphergen Biosystems公司出品的商业化的蛋白质芯片成功筛选肿瘤标志物。Adam等 ［11］ 运用此技术在前列腺癌患者的尿中发现9个蛋白质（4475、5074、5382、7024、7820、8141、9149、9507和9656D）与正常人及前列腺增生患者尿蛋白质含量不同，其灵敏度为83%，特异性为97%，阳性预测值为96%。有学者 ［12］ 采用SELDI-TOF-MS，加人工智能软件分析，检测不同PT分期乳癌患者血清中的蛋白标记物，用0.5μl血清样品点样于Ni 2+ 芯片上，用Ciphergen公司生产的PBS2分子量读取仪，检出147个质谱峰，统计分析用Propeak软件包，最后发现癌（PT023）与非癌，早期阶段癌（PT021）与非癌之间有3个蛋白峰的差异明显，区分PT024期癌与非癌，灵敏度为92%，特异性为82%，如此高的灵敏度和特异性显示该方法检测乳腺癌生物标记物具有一定潜能。王英等 ［13］ 找到了由12个差异表达蛋白及其特定组合构成的诊断模型区分食管鳞癌与健康人，其敏感性为85%（119/140）、特异性为84.4%（38/45）。另外，笔者目前正在利用SELDI蛋白芯片技术对肝病进行研究 ［14］ ;有关的研究表明肝纤维化、乙型肝炎等肝病的发病和机体免疫应答功能以及宿主遗传基因的多态性有直接的关系，如在肝纤维化的过程中，人体基因表达蛋白质谱及其在发病过程中的变化仍然是一个新的领域，而那些蛋白质的变化可以直接反映人体肝纤维化等各种肝病的病情是本领域的关键。我们利用蛋白芯片技术这一平台分析比较各个阶段肝纤维化患者的蛋白质全貌，找出它们各自的单个或一组特异的表达蛋白，并进一步分析他们的功能以及发现与其相关的基因，通过分析和监测相应蛋白质的变化、作用及时掌握病程的特点和趋势，最终通过我们系统的研究发现药物的新靶点，直接依据蛋白质的特点设计新药物。
2.3 蛋白质芯片在新药研究中的应用 新药研制一般是根据疾病的发病机制确定药物作用的靶点，建立相应的新药筛选模型，筛选不同来源的化合物，发现先导化合物，然后将其开发成新药。筛选模型建立的关键是寻找、确定和获得药物作用靶。分子生物学研究发现了很多与疾病相关的药物作用靶，它们大多数属于蛋白质类靶，如酶、受体、离子通道等，利用这些蛋白质靶已经成功地开发了一大批药物，如HMG-CoA还原酶抑制剂洛伐他定类、H 2 受体拮抗剂西咪替丁等。Gary等 ［15］ 将蛋白质芯片技术和药物结构设计以及组合化学完美地结合起来。他们采用蛋白质芯片 以检测细胞周期依赖性激酶的活性位点抑制剂（Cdc28p）对酵母细胞蛋白质水平的影响。实验包括在基因组范围检测两个结构完全不同的活性化合物以及结构类似但对Cdc28p无内在活性的第三个化合物对基因表达的影响。他们的研究首先证明了作用机制相同的药物可通过检测它们的表达图谱加以分类;同时进一步阐明了化合物的特异性和毒性是如何与潜在的分子靶点产生关联的。药物筛选的方法之一是首先寻找与体内靶分子结合的化合物，然后再分析它对靶分子功能的影响。传统的新化合物筛选是以分子功能分析和改进为主要手段，通过大量化合物合成与结合实验来确定可能有效的新药，这是一个低效率的过程。近年来，利用蛋白质芯片技术建立的化合物文库开始用于药物筛选，其中可放大的生物文库的建立和应用，以及高通量自动化药物筛选技术的出现，意味着大批量的化合物可以在很短的时间内快速地进行筛选。多个研究小组已开始致力于应用芯片技术研究药物毒性机制，以及通过比较候选化合物的表型指纹进行药物安全性的评价。药物的分子表型指纹是药物作用引起机体紊乱的基因调节模型，可在mRNA或蛋白质水平上通过基因表达图谱显示出来。不同的疾病标志物已被用于检测治疗和毒性机制。一个显著的例子是HMG-CoA还原酶抑制剂对胆固醇代谢的影响 ［16］ 。
3 蛋白质芯片的问题和应用前景
蛋白质芯片技术是一种强有力的蛋白质组学研究的新方法，从产生至今已有了很大的发展，但与基因芯片相比较，蛋白质芯片技术还处在起步阶段，无论在芯片的制备，具体应用过程以及结果的检测方面还有很多的不足。首先是成本问题，蛋白质芯片的制作工艺还相当繁琐、复杂，而且信号的检测也需要专门的仪器设备（如SELDI-TOF-MS）一般实验室都承受不起。其次，蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化便可能引起最后结果的不同，实验条件不易控制，使得实验结果的可重复性相对不足。这些问题已成为蛋白质芯片技术下一步需要重点解决的问题。目前蛋白质芯片技术的发展应加大芯片摄取蛋白质的数目和种类，尽可能多地捕获蛋白组信息，实现高通量，简化操作过程，设计蛋白芯片试剂盒，切实做到快速准确;应用计算机技术，在蛋白芯片获得的信息进行数模化处理，减少手工图谱处理带来的繁琐程序;降低工作成本，便于推广;研究联合设备，使其标识出新的蛋白后，能迅速测出氨基酸序列。相信随着对蛋白质结构和功能认识的不断深入，以及其他辅助学科和技术的发展和成熟，蛋白质芯片技术会在生命科学领域发挥重要的作用。
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作者单位:100039北京军事医学科学院附属医院临床药理室
（编辑罗 彬）