Ku蛋白与肿瘤细胞辐射敏感性

　　【摘要】  简要介绍了Ku蛋白的生物学特征和功能以及Ku蛋白与DSB修复和肿瘤细胞辐射敏感性之间的关系。对于近年来关于Ku蛋白与肿瘤细胞辐射敏感性相关性方面的研究进展及Ku蛋白作为肿瘤治疗新靶点的研究进展作一概述。

    【关键词】  Ku蛋白;DNA-PK;肿瘤细胞;辐射敏感性

　　Ku protein and the radiosensitivity of tumor cells

    GUO Chuan-ling，WANG Ju-fang，LI Wen-jian.

　　Institute of Modern Physics，the Chinese Academy of Sciences，Lanzhou730000，China

    【Abstract】 The biological properties and functions of Ku protein together with the relationship between Ku and the repair of DSB and the radiosensitivity of tumor cells were introduced.Exhibited the researches of the pertinency be-tween Ku and the radiosensitivity of tumor cells and the studies about how to use Ku as a new target for radiotherapy.

    【Key words】  Ku protein;DNA-PK;tumor cell;radiosensitivity

　　1 引言

    放疗是当今肿瘤治疗的三大手段（手术、放疗、化疗）之一，但是许多肿瘤细胞会对电离辐射产生抗性导致疗效下降。降低放疗的毒副作用、提高肿瘤细胞对放疗的敏感性一直是放疗工作人员关注的研究方向。DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSB）是电离辐射引起细胞死亡的主要原因，对DSB的强修复是一些肿瘤细胞辐射敏感性低的重要原因，另外，由于放疗一般采取分次照射的方法以保护正常组织，肿瘤细胞在两次照射之间对DSB的修复也就成为降低放疗疗效的重要原因。研究表明Ku蛋白能非特异性地结合到几乎所有DNA双链断裂（DSB）末端，在细胞由于离子辐射引起的DSB和其它生理氧化反应，V（D）J重排及药物造成的相似损伤的修复中起着重要的作用。因此，以Ku蛋白为靶点提高肿瘤细胞的放射敏感性日益受到肿瘤学家们的重视。了解Ku蛋白的生物学功能及其与肿瘤辐射敏感性的关系对于提高放疗疗效延长患者寿命意义深远。以下笔者将就Ku蛋白的生物学功能及其在肿瘤治疗中应用方面的近年研究进展作一综述。

　　2 Ku蛋白的生物学特征及功能概述

    Ku蛋白是人体细胞中含量最丰富的DNA末端结合蛋白之一，最初在多肌炎硬皮病重叠综合征患者体内作为自身抗原被发现，它的名称Ku就是来源于最早的患者名字的前两个字母，它的抗体在其它自身免疫性疾病患者体内被发现。Ku蛋白是一种含量丰富的核蛋白，在脊椎动物、昆虫、酵母和蠕虫中均有发现。人类Ku蛋白是一个约69kDa和83kDa多肽组成的二聚体，两个多肽分别称为Ku70和Ku80。人、小鼠的Ku70基因分别定位于22q13、15号染色体上，分别编码609和608个氨基酸残基的蛋白质，其上有G1u、Asp富含区和Leu拉链区。基因组DNA全长24kb，有13个外显子。果蝇YPF21β亚基是人Ku70结构类似物，但其羧基端没有DNA结合区，也没有Leu拉链。人Ku80基因定位于2q33～35，编码732个氨基酸残基的多肽，此多肽有一个“Leu拉链”，有助于Ku80通过疏水区与Ku70异二聚体化。小鼠和兔的Ku80基因定位于1号和9号染色体 ［1］ 。当人们首次利用抗体通过亲和层析将Ku蛋白分离出来的时候，发现纯化的蛋白紧紧地与线性双链DNA的自由末端结合在一起，而环状DNA，tDNA和多聚A或多聚T无法与之发生竞争。Ku能非特异性地结合到几乎所有DNA双链断裂末端，包括5′、3′末端、平端以及颈环结构的双螺旋DNA末端。Ku对于DNA末端具有很强的结合力，所以最初是作为DNA末端结合蛋白被认识的，但是现在研究表明Ku还可以和DNA碱基缺失位点、gap、发夹结构及端粒结合。有报道表明它对RNA也具弱的亲和性。Ku具有DNA依赖的ATP酶活性和ATP依赖的DNA螺旋酶活性。它是DNA依赖的蛋白激酶（DNA-dependent protein kinease，DNA-PK）的调节亚基，DNA-PK可以磷酸化许多蛋白，包括SV-40T抗原、p53、RNA聚合酶Ⅱ、RP-A、hsp90以及许多转录因子如c-Jun、c-Fos、oct-1、sp-1、c-Myc、TFIID等。Ku是一种多功能的蛋白，在许多重要的细胞生命过程中起着直接或间接的作用，如DNA双链断裂的修复，免疫球蛋白和T细胞受体V（D）J重排，免疫球蛋白构型转换，DNA复制，DNA转录的调节，同时在细胞周期的G2和M时相中起着特殊的作用 ［2］ 。此外，Sylvie M等 ［3］ 的研究还表明，Ku蛋白可作为纤维粘合素Fn的受体在细胞间的粘附中起重要的作用。Ku具有如此多种不同的生理功能，其机制还在研究之中。

　　3 Ku蛋白与肿瘤细胞辐射敏感性的关系

    3.1 Ku蛋白在DSB修复中的作用 有活性的Ku蛋白是由Ku70和Ku80两个亚基紧密结合形成二聚体，该二聚体能够作为DNA-PK的调节亚单位依赖其与DNA的结合发挥作用。越来越多的研究表明Ku蛋白在电离辐射（ionizing radiation，IR）引起的DSB和其他生理氧化反应、V（D）J重排及药物造成的相似损伤的修复中起着重要的作用。
    DNA双链断裂是一种细胞最严重的DNA损伤 ［4］ ，其可在如细胞减数分裂的同源染色体重组、V（D）J重组及某些DNA损伤修复等生理过程中作为中间产物产生;也可在外源性电离辐射和DNA断裂剂如抗癌药物、遗传毒物等损害过程中产生。与其它类型的DNA损伤相比，DSB的修复更加困难。多年来，人们对这种修复过程进行了深入的研究，逐渐了解了其机制。在生物的进化过程中，为了对抗DSB损伤，细胞形成了两条独立而又互补的DSB重组修复途径，即同源重组（homology recombination，HR）和非同源末端连接（non-homology end joining，NHEJ）。其中，最为重要的是NHEJ，它与DNA双链断裂后细胞死亡与否直接相关。NHEJ系统是哺乳细胞DSB的主要修复系统，它仅需要6～7bp的短小同源序列和（或）不需要末端同源序列情况下，即可催化G1-S期和G2期细胞进行DSB两个末端的随机连接，这种连接可发生在同一染色体或两条染色体之间 ［5］ 。一般认为NHEJ主要是通过DNA依赖蛋白激酶和XRCC4/DNA连接酶Ⅳ等成分完成的 ［6］ 。DNA-PK为整个过程的关键酶，是由DNA激活的核内蛋白激酶，包含一个大的具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的催化亚单位（DNA-PKcs）和一个由DNA结合蛋白Ku70/Ku80二聚体组成的调节亚单位 ［7～11］ 。1995年以来Ku和DNA-PK在DNA双链断裂修复重组中的重要作用研究越来越多。已经证实4种X线修复交叉互补（X-ray repair crossing-complementing，XRCC）变异的细胞（XRCC4、5、6、7）有DNA双链断裂修复缺陷 ［12］ 。XRCC5变异的细胞IR5（xrs25）缺乏编码Ku80蛋白的基因，XRCC6变异的细胞IR6（xrs26）缺乏编码Ku70蛋白的基因和XRCC7变异的细胞IR7（xrs27）缺乏编码DNA-PKcs蛋白的基因。它们对X射线敏感性能分别被XRCC5、XRCC6和XRCC7基因编码的Ku80蛋白、Ku70蛋白和DNA-PKcs蛋白所修正，这说明Ku和DNA-PKcs蛋白在DNA双链断裂修复中起着重要的作用 ［13］ 。

    大量国内外具体研究表明，Ku蛋白可在NHEJ中作为DNA-PK的调节亚基起着重要的作用 ［14］ 。DNA断裂发生后，Ku蛋白结合到断裂的DNA末端、保护游离的DNA末端避免被核酸酶分解，同时Ku与DNA末端结合即可招募DNA-PK的催化亚单位DNA-PKcs与之结合并激活其丝氨酸/苏氨酸激酶活性，使DNA-PK酶活性启动。激活的DNA-PK一方面可以招募其它参与修复的蛋白如XRCC4/DNA连接酶Ⅳ等成分并通过磷酸化调节它们的活性，在DNA末端发生一定程度的分解加工后，通过XRCC4/DNA连接酶Ⅳ作用，直接连接断裂的两端-修复DSB。另一方面DNA-PK可以作为信号分子起细胞周期的阻滞和细胞凋亡。据报道，Ku可以一种不依赖ATP的方式在DNA末端发生短距离的滑动同时维护DSB的两个末端仍然靠近在一起，这样Ku可以引起DSB末端的DNA双链的解旋，同时由于相互靠近，两个末端的微同源序列可以发生退火，退火后通过核酸外切酶切去不配对的尾巴，DNA多聚酶填补gap，最后由核酸连接酶Ⅳ连接。这一说法可以解释经常发生在NHEJ位点的DNA的小部分缺失现象 ［1］ 。

    3.2 Ku蛋白与肿瘤细胞辐射敏感性 现今的肿瘤面临的 一大问题是肿瘤细胞对于放疗的高度抗性。近年来越来越多的研究揭示了Ku蛋白在DSB修复中的重要作用，而对于DSB的修复正是肿瘤细胞产生辐射抗性的重要原因，由此科研工作者认为Ku蛋白可能通过在DSB修复中的作用影响着肿瘤细胞的辐射敏感性。于是大量的研究开始针对Ku蛋白与肿瘤细胞的辐射敏感性之间的关系开展起来。

    Tai等 ［15］ 分析14例多发性骨髓瘤细胞（MM）中的Ku86的表达情况，发现有12例细胞中Ku86异常表达为分子量为69kD的蛋白Ku86v，该蛋白截去了Ku86蛋白的C末端。Ku86v不能与DNA末端和DNA-PKcs结合，也不能激活DNA-PK的酶活性，表达Ku86v的MM细胞与正常表达Ku86的骨髓细胞及骨髓瘤结胞相比较，表现出对电离辐射的高敏感性。

    SX29细胞是小鼠乳腺癌辐射敏感突变细胞，研究认为DNA损伤修复缺陷是其辐射敏感的主要原因。Fukumura等 ［16］ 用RT-PCR克隆了SX-9的Ku70（约190bp）和DNA-PKcs（约1500bp）基因，发现Ku70基因正常，而DNA-PKcs存在一处基因突变，并认为损伤修复异常与DNA-PKcs突变有关，但是将正常DNA-PKcs导入SX-9细胞后，其V（D）J重组只恢复到亲本细胞SR-1的30%～40%。但作者未报道将正常DNA-PKcs基因导入SX-9细胞后的细胞存活率状况。江国春等 ［17，18］ 用RT-PCR克隆SX-9及其亲本细胞SR-1的Ku基因cDNA，发现辐射敏感细胞的Ku80基因与双链断裂DNA末端相互作用的位置存在基因突变，用凝胶阻滞和DNA-蛋白质印迹进一步证实突变Ku80基因编码蛋白结合双链断裂末端DNA的能力下降，提示其细胞辐射敏感性可能与Ku蛋白功能异常有关。

    Wilson CR等 ［19］ 的调研发现Ku70蛋白和（或）Ku80蛋白含量低的肿瘤细胞对放射线敏感，肿瘤细胞对放射线敏感性与Ku70基因表达水平之间存在显著的负相关关系，而与Ku80基因表达水平的负相关关系没有达到显著性。Wilson等对77例宫颈癌治疗前患者的Ku70和Ku80蛋白表达和生存率关系进行了研究，结果提示Ku蛋白缺乏导致某些肿瘤细胞放射敏感性增加。

    Hong等 ［20，21］ 获得了Ku70基因敲除小鼠并发现Ku70（-/-）小鼠相对矮小，对电离辐射超敏感。

    Komuro Y等 ［22］ 选取经活检确诊和术前放疗的96例直肠癌患者进行研究。结果表明肿瘤组织中Ku70和Ku86的表达高度相关（r=0.85，P<0.001）。Ku70的表达高低与肿瘤放疗前后T分期是否下调（放疗后评价分期低于、高于或等同放疗前），病理反应性情况（完全缓解、微小残存病灶）和临床放疗效果评定（有效、无效）有关，差异有显著性;在Ku86则仅发现其表达与放疗反应性有关，即和Ku70一样高表达者对放疗呈现出耐受倾向。

　　4 Ku蛋白在肿瘤治疗中的应用

    随着Ku蛋白与肿瘤辐射敏感性密切关系的揭示，Ku蛋白也逐渐成为了肿瘤治疗的一个新靶点。可以利用人工转化的Ku蛋白C末端肽段在肿瘤细胞中表达竞争抑制正常Ku蛋白的功能，也可通过反义RNA技术抑制Ku蛋白在肿瘤细胞内的表达或功能，从而达到提高肿瘤细胞辐射敏感性的目的。另外，有研究表明许多药物提高辐射敏感性的机制也是以Ku蛋白为靶点来实现的。

    大量研究证实Ku80的C末端是Ku蛋白与DNA末端及DNA-PKcs相互作用的结构域所在 ［23，24］ 。Elisabetta Marangoni等 ［25］ 利用pcDNA3.1真核生物表达载体将一个含Ku蛋白C末端的283氨基酸残基（449-732）的片断在高度抗辐射的小鼠卵巢癌CHO-K1细胞中表达，发现它可以降低细胞的辐射抗性。据进一步分析，该蛋白可以与Ku80竞争结合Ku70，但是形成的二聚体失去了与DNA末端结合的能力，从而降低了细胞的修复能力，提高细胞的辐射敏感性。Chunghui Kim等 ［26］ 设计一种包括Ku80蛋白C末端序列的靶肽HNI-38，发现它可以影响人乳腺癌细胞MD231和NCI中Ku70/Ku80二聚体与DNA-PKcs的结合能力从而降低了DNA-PK的酶活性，同时影响Ku与DNA末端的结合能力，从而降低DSB修复能力，提高肿瘤细胞的辐射敏感性和化学药物的敏感性。

    张捷等 ［27，28］ 把Ku80作为靶向基因，将反义Ku80分子克隆导入到肿瘤细胞（LCA细胞）完全封闭Ku80蛋白的表达，其目的在于封闭肿瘤细胞中由Ku80蛋白单独调节的DNA-PK对X线照射损伤的修复作用，结果一定程度地增加了肿瘤细胞对X射线的敏感性，为提高肿瘤放疗的特异性和靶向基因治疗奠定了基础。在此之前，他们对分子克隆后的Ku70蛋白在调节肿瘤细胞对X线照射敏感性已做了初步研究，发现单独封闭Ku70蛋白肿瘤细胞（LCA细胞）也可一定程度地增加肿瘤细胞X射线的敏感性，但不如单独封闭Ku80蛋白明显。

    同时有报道Shigenari Omori等 ［29］ 将反义Ku70RNA在人肺癌细胞中表达，封闭Ku70的活性，发现细胞对辐射和药物的敏感性也有提高。

    很多基础研究发现和Ku有关的药物肿瘤放射增敏机制。Gemcitabine有很强的放射增敏作用，但机制始终不清楚。Van等 ［30］ 发现Gemcitabine对DNA-PK的催化亚单位DNA-PKcs缺乏细胞的增敏作用与原形相似，而对Ku80蛋白缺陷的细胞却较原形有更大的放射敏感性并能为Ku80基因表达所修正。Myint等 ［31］ 利用小鼠成纤维正常细胞和Ku80蛋白缺陷细胞探讨顺铂对X线的放射增敏作用，发现顺铂对小鼠成纤维正常细胞有放射增敏作用，而对Ku80蛋白缺陷细胞则无，证明临床常用的顺铂放射增敏作用源于对DNA双链断裂非同源末端重组的抑制。

　　5 结束语

    近年来对Ku蛋白的研究很多，许多机制正在逐渐被阐明。与肿瘤有关的研究也不断扩大、深入，资料显示Ku蛋白在研究肿瘤放化疗敏感性机制和靶向治疗方面有指导意义，Ku蛋白表达的正常与否和肿瘤的阶段、进展有关，可能将利于治疗疗效的预测等。所以，对于致力于肿瘤研究的学者和工作人员来说，深入细致地研究Ku蛋白的作用和机制对肿瘤的发生、预防、诊治和预后都有重要意义。

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　　* 基金项目:科技部重大基础前期研究专项基金（2003ccb00200）;

　　国家自然科学基金重点项目（100335050）

    作者单位:1730000甘肃兰州，中国科学院近代物理研究所

    　　　　　2100039北京，中国科学院研究生院

　 （编辑:黄 杰）