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【摘要】 目的 探讨立芷雪发挥止血作用的量效关系。方法 以NIH小鼠和新西兰兔作为实验动物，研究不同剂量的立芷雪对出血时间的影响，同时探讨立芷雪对新西兰兔FDP和FIB的影响。结果当剂量在0.023、0.07、0.21、0.63ku/kg时立芷雪对新西兰兔产生明显的止血作用，但0.63ku/kg组作用弱于0.21ku/kg组，但剂量达到1.90ku/kg、5.71ku/kg 具有明显的抗凝功效；立芷雪在等效剂量时对小鼠出血时间的影响的实验也支持这一实验结果。同时立芷雪0.023、0.07、0.21、0.63ku/kg剂量组对新西兰兔FIB、FDP未见明显影响，但1.90ku/kg、5.71ku/kg剂量组具有明显减少FIB的功效以及明显增加FDP的作用。结论 立芷雪对NIH小鼠产生最佳止血作用的剂量可能在0.58～1.74 ku/kg之间; 立芷雪对新西兰兔产生最佳止血作用的剂量可能在0.21～0.63ku/kg之间，剂量达到1.90ku/kg、5.71ku/kg 具有明显的抗凝作用。
【关键词】 立芷雪；出血时间；纤维蛋白降解产物；血浆纤维蛋白原
The dose-response relationship of Reptilase on hemostatic mechanism in rabbits and mice
ZENG Lin-ling, WANG Xi-sha,YANG Wei,et al.Pharmacological Lab of Guangzhou Pharmaceutical Industrial Research Institute, Guangzhou 510240, China
【Abstract】 Objective To evaluate dose-response relationship of Reptilase on hemostatic mechanism in rabbits and mice.Methods The effects of different doses of Reptilase on BT, FDP and FIB were examined in animals.Results BT was significantly declined at the dose of 0.023, 0.07, 0.21, 0.63ku/kg for Reptilase, respectively, while the action of 0.21 ku/kg was significantly stronger than that of 0.63 ku/kg; when the dose reached to 1.90 or 5.71 ku/kg, the function of anticoagulation could be exerted significantly; the effect of equivalent dose on BT in NIH mice also supported that in New Zealand rabbit. The effect of Reptilase on FIB and FDP at the dose of 0.023, 0.07, 0.21 and 0.63 ku/kg was not observed in rabbits, the dose of 1.90 and 5.71 ku/kg could reduce the action of FIB and increase that of FDP, respectively.Conclusion The optimal dose of hemostasia action of Reptilase maybe between 0.58 and 1.74 ku/kg in NIH mice and between 0.21 and 0.63 ku/kg in rabbits, and when the dose reached to 1.90 or 5.71 ku/kg, it possess obviously increasing anticoagulation function in rabbits.
【Key words】 reptilase; BT; FDP; FIB
立芷雪（Reptilase）是从巴西矛头蝮蛇（Bothrops atrox）蛇毒中分离精制而成的酶性止血剂，主要含有两种成分：巴曲酶（Batroxobin）及微量的凝血因子Ⅹ脂依赖性激活剂（Ⅹ因子激活物）［1～3］。我国自1989年从瑞士引进巴塞尔.素高大药厂（Solco Basle Ltd）生产的立芷雪以来，由于它具有速效、高效、长效、安全、方便且不受血浆凝血酶抑制剂影响的诸多优点，因而广泛应用于出血性疾病［1，4，5］。有文献报道［1，4］：立芷雪在大剂量时可作为抗凝药物使用，并且立芷雪药品说明书上也提及“应防止药物药物过量，否则疗效会下降”，但在动物实验研究方面未见相关报道。为了进一步的了解立芷雪药效作用特点，为临床合理用药提供基础研究的依据，笔者对立芷雪的止血作用进行了量效关系研究，以期为该药的临床应用提供基础研究的依据。
1 材料
1.1 动物 新西兰兔：体重1.5～2kg，雌雄各半，86只，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2006A001。NIH小鼠：SPF级，雌雄各半，18～20g，220只，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2006A017。
1.2 受试药 立芷雪：规格：1.0ku/安瓿，1.0ku×5瓶/盒，深圳健安医药有限公司提供，批号：574405，进口注册证号：H20050102，巴塞尔.素高大药厂。
1.3 试剂 酚磺乙胺注射液（止血敏）：山西晋新双鹤药业有限责任公司，批号：200511111，规格：0.25g/（2ml·支）。肝素钠注射液：江苏万邦生化医药股份有限公司，批号：0405113，规格：12500u/（2ml·支）。FDP（血浆纤维蛋白降解产物）试剂盒：法国思达高诊断公司，批号：052361。FIB（血浆纤维蛋白原）试剂盒：法国思达高诊断公司，批号：050322。
1.4 仪器 血凝仪：TRT1 BE Thromotimer凝血时间测定仪（德国 Behnk Elektronik）。高速离心机：SIGMA 3-18K。
2 方法
2.1 立芷雪对新西兰兔出血时间、FIB、FDP的影响 新西兰兔86只，雌雄各半，检疫1周后选出72只，然后随机均衡分为9组：即空白对照组，止血敏对照组（0.047g/kg），肝素对照组（470u/kg），立芷雪1～6号组，其剂量分别为：0.023ku/kg、0.07ku/kg、0.21ku/kg、0.63ku/kg、1.90ku/kg、5.71ku/kg，按等效剂量折算，分别相当于临床用量［1ku/(人·次）］的0.5、1.5、4.5、13.5、40.5、121.5倍，药物均用生理盐水配制，各给药组按设定剂量耳缘静脉iv缓推给药1次，给药容积5ml/kg，空白对照组给生理盐水， 给药后10min、30min、2h、24h、36h测定出血时间。测定方法：将兔耳尖部的缘静脉区剪毛消毒后，用消毒的手术刀片划破耳缘静脉区，至创面出血后计时，每隔半分钟用滤纸条轻轻蘸吸直至血液不再渗出，即滤纸条上不再沾有血迹为止，记录所需时间，即为出血时间，末次测完出血时间后，将动物处死并解剖进行大体病理检查。于给药后50min耳中动脉采血测FIB（血浆纤维蛋白原）和FDP(纤维蛋白降解产物)。所获数据用SPSS11.5进行统计分析。
2.2 立芷雪对NIH小鼠出血时间的影响 NIH小鼠216只，雌雄各半，随机均衡分为9组：即空白对照组，止血敏对照组（0.13g/kg），肝素对照组（1290u/kg），立芷雪1～6号组【其剂量分别为：0.06ku/kg、0.19ku/kg、0.58ku/kg、1.74ku/kg、5.22ku/kg、7.83ku/kg，按等效剂量折算，分别相当于临床用量［1ku/(人·次）］的0.5、1.5、4.5、13.5、40.5、60.75倍,说明：由于预试实验结果表明在大于10ku/kg时，小鼠会出现明显急性毒性反应，因此6号剂量组设定为5号剂量组的1.5倍】，每组24只，其中每组一半动物用于测定30min及24h的出血时间，另一半动物用于测定2及36h的出血时间。药物均用生理盐水配制，各给药组按设定剂量尾静脉iv给药1次，给药容积10ml/kg，空白对照组给生理盐水， 给药后30min、2h、24h、36h测定出血时间。测定方法：剪尾法：第一次剪0.8cm，第二次剪0.2cm，剪尾后至创面出血后计时，每隔0.5min用滤纸条轻轻蘸吸直至血液不再渗出，即滤纸条上不再沾有血迹为止，记录所需时间，即为出血时间；说明：本试验出血时间超过25min则以25min计，同时给动物进行止血处理。
3 结果
3.1 立芷雪对新西兰兔出血时间、FIB、FDP的影响
3.1.1 立芷雪对新西兰兔出血时间的影响 实验结果（表1）表明：给药后10min：立芷雪1号组与空白对照组相比出血时间有减少的趋势，但差异无显著性（P>0.05）；2号组、3号组、4号组与空白对照组相比出血时间明显减少（P<0.01），其中，3号组出血时间稍短于2号组和4号组；立芷雪5号组、6号组与空白对照组相比出血时间明显延长（P< 0.01），并有一定的量效关系。给药后30min：立芷雪1号组、2号组、3号组、4号组与空白对照组相比出血时间明显减少（P<0.05或0.01），其中，3号组出血时间短于2号组和4号组；立芷雪5号组、6号组与空白对照组相比出血时间明显延长（P< 0.01），并有一定的量效关系。给药后2h：立芷雪1号组、4号组与空白对照组相比出血时间有减少的趋势，但差异无显著性（P>0.05），立芷雪2号组、3号组与空白对照组相比出血时间明显减少（P<0.05或0.01）；立芷雪5号组、6号组与空白对照组相比出血时间明显延长（P<0.05或0.01），但延长的程度较30min时轻。给药后24h：立芷雪1号组、2号组、3号组、4号组与空白对照组相比出血时间差异无显著性（P>0.05）；但立芷雪5号组、6号组与空白对照组相比出血时间明显减少（P<0.05）。给药后36h：立芷雪各剂量组与空白对照组相比出血时间差异无显著性（P>0.05）。表1 立芷雪对新西兰兔出血时间的影响注：与空白对照组相比出血时间缩短，*P<0.05,**P<0.01；与空白对照组相比出血时间延长，#P<0.05,##P<0.01，*P<0.05,**P<0.01
3.1.2 立芷雪对新西兰兔FIB的影响 FIB的影响实验结果（表2）表明：新西兰兔耳缘静脉给药后50min，立芷雪5、6号组与空白对照组相比FIB浓度明显降低（P< 0.01），但立芷雪其余各剂量组与空白对照组相比FIB浓度差异无显著性（P>0.05）。 表2 立芷雪对新西兰兔FIB的影响注：与空白对照组相比FIB含量降低，*P<0.05，**P<0.01；*P<0.05,**P<0.01
3.1.3 立芷雪对新西兰兔血浆FDP（半定量法）的影响 实验结果（表3）表明，新西兰兔耳缘静脉给药后50min，与空白对照组相比，立芷雪各剂量组FDP的含量随剂量增加而增加，具有较好的剂量关系，与血浆FIB检测结果提示的临床意义基本一致。表3 各组血浆FDP测定结果
3.1.4 立芷雪对新西兰兔血液流变学的影响 各组动物实验结束后处死剖检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、消化及呼吸系统等肉眼均未见异常。
3.2 立芷雪对NIH小鼠出血时间的影响 实验结果（表4）表明：给药后30min：立芷雪1号组与空白对照组相比出血时间有减少的趋势，但差异无显著性（P>0.05）；2号组、3号组、4号组与空白对照组相比出血时间明显减少（P<0.01），其中，3号组出血时间稍短于2号组和4号组；立芷雪5号组、6号组与空白对照组相比出血时间明显延长（P<0.05或0.01）。给药后2h：立芷雪1号组与空白对照组相比出血时间有减少的趋势，差异无显著性（P>0.05）；立芷雪2号组、3号组、4号组与空白对照组相比出血时间明显减少（P<0.05或0.01），但立芷雪2号组、3号组减少的程度较30min时轻，并且4号组出血时间短于3号组和2号组；立芷雪5号组、6号组与空白对照组相比出血时间明显延长（P<0.05或0.01），但延长的程度较30min时轻。给药后24h：立芷雪1号组、2号组、3号组、4号组与空白对照组相比出血时间差异无显著性（P>0.05）；但立芷雪5号组、6号组与空白对照组相比出血时间明显减少（P<0.05或0.01）。给药后36h：立芷雪各剂量组与空白对照组相比出血时间差异无显著性（P>0.05）。表4 立芷雪对小鼠出血时间的影响注：与空白对照组相比出血时间减少，*P<0.05,**P<0.01；与空白对照组相比出血时间延长，#P<0.05,##P<0.01，*P<0.05, **P<0.01
4 讨论
立芷雪具有强烈的止血作用，但这种作用只在血管破损处发生，立芷雪在正常血管内无凝血作用，相反会降解纤维蛋白原，因而在大剂量时（50～100ku/次，及止血剂量的50～100倍）作为抗凝血药物使用［1,2,4］。因此，笔者探讨了不同剂量的止血作用，希望能为临床合理评价该药及应用该药提供基础研究的依据。
根据上述实验结果可以认为：当剂量在0.023、0.07、0.21、0.63ku/kg时立芷雪对新西兰兔产生明显的止血作用，但0.63ku/kg组作用弱于0.21ku/kg组，但剂量达到1.90ku/kg、5.71ku/kg 具有明显的抗凝功效；立芷雪在等效剂量时对小鼠出血时间的影响的实验也支持这一实验结果。同时立芷雪0.023、0.07、0.21、0.63ku/kg剂量组对新西兰兔FIB、FDP未见明显影响，但1.90ku/kg、5.71ku/kg剂量组具有明显减少FIB的功效以及明显增加FDP的作用。从而可以推测立芷雪在过大剂量使用时能够使实验兔的纤溶亢进，从而发挥抗凝作用。这与文献报道［4］“立芷雪降解纤维蛋白原而生成纤维蛋白，进而形成FIp (纤维蛋白Ⅰ多聚体)， FIp在正常血管内生成FDP有关，由于立芷雪剂量过大，生成FDP的量大于被体内吞噬系统吞噬、代谢的量，从而发挥抗凝血作用”这与文献报道［4］“立芷雪降解纤维蛋白原而生成纤维蛋白，进而形成FIp (纤维蛋白Ⅰ多聚体)， FIp在正常血管内生成FDP有关，由于立芷雪剂量过大，生成FDP的量大于被体内吞噬系统吞噬、代谢的量，从而发挥抗凝血作用”相一致。进一步分析可以认为立芷雪对新西兰兔产生最佳止血作用的剂量可能在0.21～0.63ku/kg之间［按等效剂量折算为成人临床用量为4.5～13.5ku/(人·次）］；剂量达到1.90ku/kg、5.71ku/kg 具有明显增加纤溶的作用从而表现出明显的抗凝功效。立芷雪对NIH小鼠产生最佳止血作用的剂量可能在0.58～1.74ku/kg之间［按等效剂量折算为成人临床用量为4.5～13.5ku/(人·次）］；剂量达到5.22ku/kg、7.83ku/kg 时表现出明显的抗凝功效。
根据上述分析，笔者认为立芷雪在一定范围内立芷雪的止血作用随剂量增加而增强，并且对纤溶系统无明显影响；在大剂量使用时，应该具有明显增加纤溶的作用，从而表现出抗凝作用，并且可以推断立芷雪最佳有效止血剂量可能在4.5～13.5ku/(人·次）范围内，建议临床在探索立芷雪最佳有效止血剂量时注意观察4.5～13.5ku/（人·次）剂量时的功效，剂量不宜超过13.5ku/(人·次），但考虑到人与动物的种属差异性，故临床最终的使用方法得根据临床研究的结果综合分析而定。
【参考文献】
1 杨威，曾琳玲，王茜莎，等.立芷雪对新西兰兔出血时间及凝血功能的影响. 中国药房，2007排版待发.
2 James EF，Reynolds，Martindale. The extre pharmacopoeia，30th Edition， Singapore: the Royal Pharmaceutical Society of Great Britain，1993，923.
3 James EF，Reynolds， Martindale. The extre pharmacopoeia， 29th Edition， Singapore: the Royal Pharmaceutical Society of Great Britain，1989，1132.
4 康佐文，时凯，黄国章. 立止血的研制历史及其应用概况. 蛇志，2000，12(4):62-64.
5 莫伟南，尚玉新，郑明新. 速效、高效、长效、安全、方便的止血药--立止血. 中国药房，1996，7(3):137-138.
*基金项目：广东省关键领域重点突破项目“华南创新中药研究开发与技术服务中心（平台）”资助项目
作者单位： 1 510240 广东广州，广州市医药工业研究所药理研究室
2 510240 广东广州，广东药学院药科学院药理教研室（△通讯作者）
(编辑：邓 锋)