点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨TGF-β及其受体TGF-β R1和TGF-β R2在小鼠小肠上皮细胞受照射后再增殖中的作用及其意义。方法 C3HF/Kam小鼠全身一次性5Gy照射后，不同时间内杀死小鼠取出空肠，HE染色后计数隐窝细胞数和分裂相，同时以免疫组化结合计算机图像分析技术定量测定照射后不同时间内TGF-β、TGF-β R1和TGF-β R2在隐窝区和绒毛区的表达。结果 照射后3～4天小鼠小肠隐窝细胞和分裂相均达到高峰。而照射后一天TGF-β表达在绒毛区和隐窝区即下降至最低点；同时TGF-β R1和TGF-β R2也不同程度的下降。结论 TGF-β、TGF-β R1和TGF-β R2在小鼠小肠上皮细胞受照射后的再增殖过程中可能起着负反馈的调节作用。
【关键词】 小鼠小肠；照射；TGF-β；TGF-β R1；TGF-β R2
The role of expression of TGF-β,TGF-β and TGF-β R2 in the repopulation of mouse jejunum after irradiation
YAO Wei-qiang,Luka Milas.
Cancer Hospital of Fu Dan University,Shanghai 200032,China
【Abstract】 Objective To study the role of expressions of TGF-β,TGF-β R1 and TGF-β R2 in repopulation of jejunum following irradiation.Methods Using the jejunum of C3HF/Kam mouse as material,the mitotic index and the number of crypt cells were measured at different times after single whole body irradiation of 5Gy.At the same time,the expressions of TGF-β,TGF-β R1 and TGF-β R2 in crypt area and villi area were also tested quantitatively by automated immunohistochemical staining method.Results The mitotic index and the number of crypt cells reached peaks three-four days after irradiation.Meanwhile,the expression of TGF-β in crypt area and in villi area showed the lowest value one day after irradiation and the expreesions of TGF-β R1,2 decreased in some degrees both in crypt and in villi.Conclusion The results indicate that the decreased expression of TGF-β, TGF-β R2 play the negative feed back role in repopulation of mouse jejunum after irradiation.
【Key words】 mouse jejunum；irradiation；TGF-β；TGF-β R1；TGF-β R2
已有研究表明，小鼠小肠的隐窝细胞是小肠的干细胞，小鼠小肠的再增殖开始于照射后的第3天。笔者的初步研究表明，小鼠小肠上皮照射后的再增殖与转化生长因子TGF-α，上皮生长因子EGF及其受体EGF-R密切相关，TGF-α、EGF及EGF-R很可能在小鼠小肠上皮再增殖过程中起着类似“触发”信号的作用［1，2］。然而，小肠上皮的增殖过程是一“自控系统”，它的过程必然受多种因子的调节。本文研究另一类转化生长因子TGF-β及其受体在小鼠小肠上皮受照射后再增殖中的作用。
1 材料和方法
实验采用16周龄的雄性C3HF/Kam纯系小鼠。放射源为250kV的X射线，吸收剂量率为1.6Gy/min。照射时将小鼠置于特制的有机玻璃盒内，小鼠不麻醉。全身一次照射吸收剂量为5Gy。照射后不同时间拉颈处死小鼠，取出空肠，浸入10%福马林中，石蜡包埋。每个时间点取3只动物，每只动物取3张切片。
部分切片常规HE染色后，高倍镜下计数每个隐窝的隐窝细胞数及分裂细胞。计数前者时取每50个隐窝的平均细胞数；计数后者时共计数500个隐窝细胞，然后换算成百分比。
TGF-β及其受体TGF-β R1和TGF-β R2的表达测定采用ABC染色法。羊抗鼠的抗TGF-β 、抗TGF-β R1、抗TGF-β R2的单抗隆抗体及配套的试剂盒均为Sigma公司的产品。测试步骤为：石蜡切片脱蜡水化；缓冲液洗涤3次，马血清保护；第一抗体孵育60min，缓冲液洗涤：0.3%H2O2甲醇液阻断内源性过氧化物酶5min；ABC试剂孵育：0.04%DAB 显色；流水洗涤：苏木素复染5min；脱水后透明封固。上述步骤均在室温下完成。
免疫组化的定量测定：将已染色的玻片置于显微摄像机下，摄取后储存于计算机内，然后以特别编制的程序分别对绒毛区及隐窝区的染色进行定量处理，从而分别得到上述参数在绒毛区和隐窝区的定量表达，结果相对值的定义为该蛋白质表达的含量。该套分析程序由MD Anderson癌症中心生物统计室自行研制，详见文献［3］。
2 结果
照射后第3天隐窝细胞的分裂相显著上升，几乎达到照射的一倍，第4天仍维持在高分裂水平。表明隐窝细胞在照射后第3天开始再增强。相应地，隐窝细胞也在照射后第3～4天达到高峰。
照射后1天，TGF-β在隐窝区及绒毛区的表达均降到最低点，照射后第2天即迅速恢复，到第3～4天已基平到照射前水平(图1、2)。在绒毛区，照射后第1天，TGF-β R1的表达也降到最低点，以后逐渐恢复，但直到照射后第4天仍然低于照前的水平(图3)。在隐窝区，TGF-β R1表达的变化在照射前后未见明显差异。照射后1天TGF-β R2在隐窝区的表达明显降低，但到第2天即已恢复到照射的水平(图4)。TGF-β R2在绒毛区的表达在照射后第1天即见下降，以后有所升高，但一直低于照射前的水平(图5)。
3 讨论
TGF-β是一种多效能因子，已发现有5种异构体，其相关的受体也多达8～9种之多，限于条件，本研究仅测定了2种受体。多种受体中，受体Ⅰ和受体Ⅱ已知与TGF-β有特异性较高的亲和力，被认为参与TGF-β的信号传递［4］。TGF-β及受体广泛参与细胞基质的形成，在放射性肺炎的纤维化形成中起着重要作用［5］。新近的研究还发现，TGF-β 对放射后的小肠的坏死、硬化和纤维化形成起到关键性作用［6］。
目前不少放射生物学家以为TGF-β及其受体是后期放射反应的主要介导物之一。TGF-β的另一功能是抑制上皮细胞的增生。本实验结果表明，放射后第1天TGF-β无论在隐窝区还是在绒毛区均下降到最低点。其下降出现于细胞分裂高峰之前。而TGF-β R1和TGF-β R2分别在绒毛区和隐窝区表达下降。另一方面，TGF-β恢复较快，但其受体恢复则较慢。TGF-β及其受体的上述变化在时空上的差异可能与受体的多样性有关。本实验结果提示，TGF-β及其受体的下降可能解除了小肠上皮细胞增殖受抑的状态，使其能迅速增殖。随后TGF-β又恢复照射前水平可能终止了小肠上皮细胞的再增殖，使这种增殖过程始终处于正常的生理状态下。因此，TGF-β及其受体可能是小肠上皮增殖的负反馈调节信号。由于TGF-β的受体多达8～9种，因而其变化规律也较复杂，有待于进一步研究。
【参考文献】
1 姚伟强，Milas Luka.照射后TGF-α、EGF及其受体EGF-R表达在小鼠小肠上皮细胞再增殖过程中的作用.中华放射肿瘤学杂志，1997，7：22-24.
2 姚伟强，Milas Luka.Genistoin对小鼠小肠上皮细胞照射后再增殖和TGF-α、EGF-R表达的影响.中华放射医学与防护杂志，1999，19：262-263.
3 Ruifrork AG.Quantification of immunohistochemical staining by color translation and automated thresholding.Anal Ouant Cytol Histol,1996,18:1-7.
4 杜静.转化生长因子β的结构、受体及作用方式.国外医学·免疫学分册，1996，19：22-25.
5 Rubin P,Finkelstein J,Schapiro D.Molecular biology mechanisms in the radiation induction of pulmonary injury syndromes:Interrelationship between the alveolar macrophage and the septal fibroblast.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1992,24:93-100.
6 Rodemann HP,Bamberg M.Cellular basis of radiation-induced fibrosis.Radiotherapy and Oncology,1995,35:83-101.
基金项目：本课题受美国Mammad Soudavar纪念基金资助(项目号：P-1-739)
作者单位：1 200032 上海，复旦大学肿瘤医院
2 美国MD Anderson癌症中心
(编辑：罗 彬)