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【摘要】 目的 了解三种培养基对兔精子体外培养的效果及不同超数排卵药物与雌兔超排结果和生殖激素水平变化的关系。方法 采用精液在三种培养基中培养的实验。对雌兔肌注PMSG 75u或HMG 20u 2天，第2天肌注HCG 80u超排试验。采用化学发光仪测定雌兔生殖激素。结果 三种培养基的精子活率24h均无差异，但48和72h在BWW液中有差异。精子活力在24、48和72h在BWW液中与在F10液和M199液中有差异。注射PMSG的雌兔平均卵子数为7.8个，胚胎数为6.6个；注射HMG的雌兔平均卵子数为15个，胚胎数为25个。注射PMSG或 HMG后FSH、LH、P有较显著升高，E2-6也有升高，T无明显变化。结论 BWW培养基是精子体外培养较好的培养基。HMG的超排效果优于PMSG。肌注HMG或PMSG对雌兔FSH、LH、E2-6、P的平均水平变化有关。
【关键词】 兔；精液；促性腺激素；超数排卵； 生殖激素
A study of rabbit pregnancy-supporting model
LU Jing,JI Yuan,RONG Ying，et al.
Chongqing Academy of Population and Family Planning, Chongqing 400020, China
【Abstract】 Objective To observe rabbit sperm culture in three different culture media and find out the correlation between different superovulation drugs and the actual superovulation and the change of FSH, LH, E2-6, P and T in rabbit serum. Methods The semen was cultivated in three different culture media placed in a culture machine whose temperature was 37℃. PMSG(75 U) or HMG(20 U) were intravascularly injected once a day for two days and HCG(80U) was injected on the third day. The chemoilluminance system was used to test FSH, LH, E2-6, P, and T in rabbit serum.Results In all the three cultural media the motility of the sperm remained the same at 24 hours. At 48 and 72 hours,however, the motality differed in BWW. However, the vitality of the sperm in BWW differed from that in F10 and M199 at 24, 48 and 72 hours. After the injection of PMSG, 7.8 eggs and 6.6 embryos were collected from each rabbit on average. After the injection of HMG, an average of 15 eggs and 25 embryos was collected. After the injections FSH, LH, P largely increased. E2-6 also increased. But T remained almost the same.Conclusion BWW is a good medium for external sperm culture. HMG leads to more superovulation than PMSG does. The intramuscular injection of HMG or PMSG correlates with the change of FSH, LH, E2-6 and P in rabbit serum.
【Key words】 rabbit；semen；gonadotrophin；superovulation；reproductive hormone
人类对于动物生殖的调控能力，是随着对动物生殖生理认识、了解的增加以及相关学科的发展而逐渐提高的［1］。选择优良的精子既能显著提高繁殖率，又能节省高昂的费用。为了选择有效、方便、经济的培养基，笔者对BWW培养基、F10培养基、M199培养基进行了对比实验研究。
超数排卵是胚胎生物工程中一个重要环节。本研究对雌性新西兰大耳白兔肌肉注射孕马血清促性腺激素（PMSG）或尿促性腺激素（HMG）进行超数排卵［2］，并以获取的卵子数和胚胎数为指标，分析使用这两种促性腺激素的超排结果，同时记录回收卵、回收胚的最佳时间，为体外授精、胚胎的获取和植入提供临床依据。使用不同超数排卵药物后雌兔生殖激素水平变化的报道甚少。本研究在超排结果研究的同时进行了雌兔使用HMG或PMSG前后血清FSH、LH、E2-6、P和T的测定，以了解超数排卵药物对生殖激素水平的影响以及生殖激素与超数排卵的关系。
1 材料与方法
1.1 家兔精子培养基的筛选
1.1.1 材料 新西兰大耳性成熟兔，由第三军医大学实验动物中心提供，雄兔体重3.4±0.4kg，雌兔体重3.2±0.2kg，分笼饲养。
1.1.2 方法 采用假阴道法采集精液，精液放入37℃恒温水浴箱中，液化，分成三份，分别加到2ml的BWW培养基、F10培养基和M199培养基中，37℃爬高30min，取上清液、离心，用三种各自的培养基洗涤两次取沉淀物，精子浓度调为10×106/ml，37℃培养，分别在24h、48h和72h离心、换液，制备细胞悬液，镜下观察精子活率和活力。
1.2 家兔超排、卵及胚胎的回收、囊胚的植入
1.2.1 材料 新西兰大耳白雌兔（来源同1.1.1）40只，兔龄6～12月。实验前随机分成两组，Ⅰ组10只，PMSG超排。Ⅱ组30只，HMG超排。雄兔6只，都具有生育力（其中2只结扎，用于假孕兔诱导排卵），另外4只有过生育史的雌兔作受体兔。
1.2.2 方法
1.2.2.1 超排处理 采用两种方法，一种为PMSG+HCG法，每次实验选Ⅰ组2只发情雌兔，每天肌肉注射PMSG (75u)1次，连续2天，第3天肌肉注射HCG 80u，立即与雄兔合笼交配。其中1只用于取卵（与结扎雄兔合笼），另1只用于取胚。另一种为HMG+HCG法，每次实验选Ⅱ组4只发情雌兔，分别每天肌肉注射HMG (20u)1次，连续2天，第3天肌肉注射HCG 80u，立即与雄兔合笼交配。其中2只用于取卵（与结扎雄兔合笼），另2只用于取胚。
1.2.2.2 卵子的回收 分别将合笼后15h的Ⅰ组和Ⅱ组实验兔处死。剖腹取出双侧卵巢、输卵管、子宫、阴道组织。用文镊固定提起后，观察卵巢表面的卵泡发育情况，用钝性针头吸M199液，通过输卵管伞端，轻轻加压推入液体，慢慢冲洗输卵管和子宫，经阴道将卵泡回收到平皿中，静置，解剖显微镜及相差显微镜下记录回收卵子数，再放入M199培养基中，加灭菌石蜡油，37℃培养观察。
1.2.2.3 囊胚的回收 Ⅰ组和Ⅱ组实验兔合笼，96～106h处死，剖腹取胚，通过输卵管伞端和子宫角，用杜氏液冲洗，经阴道回收冲胚液，静置，肉眼检胚，显微镜观察，照相。
1.2.2.4 囊胚的植入 选择两只受体兔，术前3天肌肉注射HCG 80u/只/次/天，连续给药3天后与结扎雄兔合笼，刺激排卵作假孕受体兔。将发育良好的10个囊胚植入假孕受体兔的左右子宫，固定，观察4h后放入笼中饲养。
1.3 大耳白兔的生殖激素变化
1.3.1 材料 实验兔分组同1.2.1，分别于注射药物前和交配后15h（取卵组）和96h（取胚组）耳静脉取血3ml，测定血清中的激素含量。
1.3.2 方法 用Bayer ACS:180 全自动化学发光仪检测血清FSH、LH、E2-6、P和T，所用试剂盒均由Bayer公司提供，严格按试剂盒说明书操作。
2 结果
2.1 精子在三种培养基中各时间点的活率、活力结果 见表1。
表1 三种培养基的活率和活力比较 略
2.2 雌兔肌注PMSG或HMG后的超排结果 见表2、表3。
表2 PMSG或HMG超排卵后取卵结果 略
表3 PMSG或HMG超排卵后取胚结果 略
2.3 实验兔注射药物前后生殖激素水平的变化 见表4、表5。
表4 取卵实验兔的生殖激素比较 (略)
表5 取胚实验兔的生殖激素水平比较 (略)
3 结论与讨论
(1)F10、M199细胞培养基的主要成分是氨基酸和维生素，但对精子的体外存活并不能提供有效的支持。在我们的研究中发现，这两种细胞培养基中精子的存活时间为1～2天。而BWW液含有NaCl、KCl、CaCl(2H2O)、K2HPO4、MgSO4(7H2O)、NaHCO3、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖和人血清白蛋白，能有效地支持精子在体外存活，其最长时间可达5天；有助于体外精子的活力和活率的增强，适用于人工授精。 在我们的研究中还发现精液在培养过程中，由于精子代谢产物乳酸的积累，pH值降低，直接影响精液质量。为此，我们在BWW培养液中用磷酸氢二钠调整pH值，使精液能在普通恒温箱进行培养［3］。
(2)HMG+HCG的超数排卵效果和囊胚的回收率均比PMSG+HCG好。在取卵和取胚的过程中发现，连续两天用HMG肌肉注射20u/只/次，第3天肌肉注射HCG 80u/只，即与结扎雄兔合笼，合笼后15h左右取卵较合适； 96h取囊胚效果较好，但不能超过106h（时间过长已植入子宫内膜，不易取出）。
(3)超数排卵药物肌肉注射与报道的静脉注射效果相同，但肌肉注射简便可靠,更易操作［4、5］。我们认为M199液作为冲卵液最好，杜氏液作为冲胚液及培养液效果更好。我们经雌兔阴道植入囊胚，使其成功生产了仔兔7只，从中观察到导管的选用很重要。
(4)生殖激素在动物的体内，尤其对动物的繁殖，具有非常重要的作用［６］。注射HMG+HCG或PMSG+HCG后雌兔血清FSH、LH、P都有较显著的升高，血清E2-6也有升高，血清T变化不大。而取卵组血清LH、E2-6的增高比取胚组明显，取胚组中血清FSH、P增高比取卵组明显；即激素LH、E2-6的增高早于FSH、P的增高。本实验结果表明，超排卵药物对生殖激素有明显促进增加作用。
【参考文献】
1 王建辰.动物生殖调控.合肥：安徽科学技术出版社，1998，65.
2 谭世俭，李雪峰，谭丽玲，等.家兔超数排卵结果报道.广西农业大学学报，1994，3：93-97.
3 向天浩.家兔超数排卵和胚胎体外培养试验.河南农业科学，1994，4：39-40.
4 杨文胜.母兔超数排卵方法的研究.实验动物科学与管理，1996，4：8-10.
5 李秦.不同激素对哺乳动物超数排卵作用的研究.实验动物科学与管理，1997，3：1-6.
6 张德福.家兔交配前后促黄体素、孕酮、雌二醇.中国养兔杂志，1992，2：15-17.
作者单位：1 400020 重庆，重庆市人口和计划生育科学技术研究院
2 310058 浙江杭州，浙江大学医学院
(编辑：罗 彬)