荧光定量RT-PCR检测AFP mRNA基因表达

    【摘要】  目的  建立荧光定量RT-PCR方法检测AFP mRNA基因表达的方法，了解肝癌组织中AFP mRNA的表达水平。方法  用荧光定量PCR方法检测33例肝癌及癌旁组织AFP mRNA表达水平。结果  33例肝癌组织和癌旁组织AFP mRNA表达均阳性，肝癌组织AFP mRNA的平均水平为5.8110±0.9488，癌旁组织AFP mRNA的平均水平为3.4432±0.4891。结论  荧光定量RT-PCR检测AFP mRNA基因表达方法，定量准确可靠，有利于标准的统一。肝癌组织中AFP mRNA含量显著高于癌旁组织。

　　【关键词】  肝癌；AFP mRNA；荧光定量PCR
   
　　Real-time  PCR  for  the  detection  of  AFP mRNA  in  liver  cancer  tissue  and  its  surrounding  tissues

　　ZHANG Yan，HE Dong-hua，Yan Lei，et al.

　　School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou，Guangdong 510275，China

　　【Abstract】  Objective  To establish a fluoregenic probe quantitative RT-PCR(FQ-RT-PCR) method for detecting the expression of AFP mRNA in liver cancer tissues.Methods  Real-time PCR was used to detect the 33 patients liver cancer tissues and its surrounding tissues.Results  AFP mRNA was expressed in all of 33 liver cancer tissues and its surrounding tissues. In liver tissues， the level of AFP mRNA is 5.8110±0.9488， and in its surrounding tissues is 3.4432±0.4891.Conclusion  The AFP mRNA gene expression detected with the FQ-RT-PCR could be get an accurate quantitative result and the gene expression level be judged easily.Moreover， higher levels of AFP mRNA gene expression were observed in liver cancer than that in non-neoplastic portions of liver.

　　【Key words】  hepatocellular carcinoma； AFP mRNA；FQ-RT-PCR

    原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在我国是第3位恶性肿瘤，每年约有11万死于肝癌，严重威胁人类健康。甲胎蛋白（AFP）是肝癌的标志物之一。常规检测AFP mRNA基因表达，多采用竞争RT-PCR法定量分析［1］，但它属于PCR终点检测法，在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大，很难对起始模板数准确定量，此外常规RT-PCR方法还存在因产物污染而导致的假阳性、非特异性扩增、电泳操作造成误差及EB对人体的伤害等问题，这大大限制了其在临床中的推广应用。本研究应用荧光定量PCR技术对肝癌特异性基因AFP mRNA进行定量检测。现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  病例选择及取材  收集住院确诊的原发性肝癌病人33例，年龄45～65岁，平均56岁。术中切取少量新鲜的肝癌组织及癌旁1cm的肝组织，迅速至-80℃冻存。

　　1.2  引物、探针的设计合成  从Genebank中调出AFP的DNA和RNA序列，根据引物设计原则，上游引物位于外显子1和2之间，序列为5'－TGGAATAGCTTCCATATTGGGATTC－3'，下游引物位于外显子3上，序列为5’－CCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTT－3’。引物由上海博亚生物有限公司合成。

    根据美国PE公司提供的引物探针设计软件，设计的MGB探针序列如下：5’（FAM）－TACTGCAGAGATAAGTTT－3’（TAMRA）探针是由上海基康生物工程公司合成。

　　1.3  组织总RNA的提取  取冻存的肝癌组织及癌旁组织各约0.1g，采用Trizol（Invitrogen公司）提取组织的总RNA，操作按说明进行。提取后的RNA测A260-A280吸光值，要求A260/A280比值为1.8～2.0，并计算出RNA含量。

　　1.4  cDNA的合成  取2μg组织标本总RNA，加入15pmol的AFP mRNA的下游引物和DEPC水，70℃预变性5min，立即放于冰上，然后加入5×RT Buffer 5μl，10mmol dNTPs 5μl，RNasin 25u，M-MLV 200u，37℃ 反应1h，95℃ 5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置于－20℃备用。

　　1.5  荧光定量RT-PCR检测临床组织标本的AFP mRNA  荧光定量PCR检测临床组织标本的AFP mRNA的反应体系： 5×PCR buffer 10μl、上下游引物各15pmol、10mmol dNTPs 1μl、探针7.0pmol、Taq DNA聚合酶3u、AFPmRNA的cDNA或阳性定量模板5μl，加无菌去离子水至50μl。反应条件为：93℃ 2min，93℃ 30s，60℃ 1min，共40个循环。反应在PE7700（美国PE公司）扩增仪上进行。反应结束后用计算机将样本与标准曲线对比得出AFP mRNA基因表达的拷贝数。

　　1.6  统计学处理  本实验数据计量资料采用几何均数±标准差（x±s），两组样本间均数比较采用独立样本t检验（并做方差齐性检验）。P＜0.05为差异有显著性。

　　2  实验结果

　　2.1  荧光定量PCR检测肝癌及癌旁组织AFP mRNA扩增动力学曲线图和定量标准曲线图  见图1和图2。

　　2.2  肝癌组织和癌旁组织内AFP mRNA检测结果  在33例肝癌组织和癌旁组织，AFP mRNA均表达阳性，阳性率以为100％；肝癌组织的AFP mRNA平均水平为5.8110±0.9488（拷贝数取对数）；癌旁组织AFP mRNA的平均水平为3.4432±0.4891，与癌旁组织相比，肝癌组织AFP mRNA的含量远远高于癌旁组织，且经统计学分析两组间差异有显著性（P＜0.01）。见表1。

　　表1  肝癌组织和癌旁组织AFP mRNA的检测结果　略

　　2.3  肝癌组织内AFP mRNA含量与血清AFP的关系  12例血清AFP阴性的肝癌患者，其癌组织AFP mRNA检测含量为5.7708±0.8111（拷贝数取对数）；21例血清AFP阳性的患者其癌组织AFP mRNA的平均水平为5.4733±1.1595，两者间差异无显著性（P＞0.05）。见表2。

　　表2  肝癌组织AFP mRNA检测结果与血清AFP水平的关系　略

　　3  讨论

　　荧光定量PCR是近两年发展起来的一项新技术［2～5］。该技术既巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性，探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性及计量高准确性等优点，同时又克服了普通PCR技术易污染、不能定量、探针杂交灵敏度不高、分离洗脱条件不易控制等不足。而且检测结果用拷贝数来表示起始模板的含量，相对半定量RT-PCR中的比较值更为准确可靠，有利于定量标准的统一，便于不同的实验室之间进行比较，因此在疾病的基因诊断中有广阔的应用前景。

　　为进一步明确肝癌组织与癌旁组织的AFP基因转录水平的改变，我们首次应用荧光定量PCR定量检测AFP mRNA的方法对33例肝癌组织、癌旁组织中AFP mRNA进行定量分析。结果表明肝癌组织中AFP mRNA的平均水平105分子数/μgRNA，而癌旁组织中AFP mRNA的平均水平仅为103分子数/μgRNA，肝癌组织中AFP mRNA的表达水平比其癌旁组织平均高出2个数量级。这一结果与Matsumura M报道一致［6］。在本研究中12例血清AFP阴性（＜200μg/L）的原发性肝癌患者中，其肝癌组织AFP mRNA表达阳性，说明AFP mRNA比血清AFP更敏感，联合检测癌组织AFP mRNA可能有助于提高血清AFP阴性或低阳性肝癌的确诊率。今后，我们将进一步应用荧光定量RT-PCR方法对肝癌患者外周血中AFP mRNA定量检测，探讨其表达水平与临床参数的关系及其在诊断肝癌微转移病灶的可行性。
   
　　(本文图片略)

　　【参考文献】

　　1  杜智，齐之丽，高英堂，等.竞争性RT-PCR定量检测AFP mRNA在肝癌组织中的表达. 中国肿瘤临床， 2005，32（1）：111－113.

　　2  Lee LG，Connel CR，Bloch W，et al. Discrimination by nicktranslation PCR with fluogenic probe. Nuckeic Acids Res，1993，21(16):3761-3766.

　　3  Livak KJ，Flood SJA，Marmaro J，et al  Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization.  PCR Methods Appl，1995，4(6):357-362.

　　4  Gibson UE， Heid CA， Williams PM. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res，1996，6(10):995-1001.

　　5  Haid CA， Stevens J，Livak KJ，et al  Real-time quantitative PCR. Genome Reseach， 1996，6(10):986-994.

　　6  Matsumura M，Ijichi M，Shiratori Y，et al. Simple quantitative assay of alpha-fetoprotein mRNA in liver tissue using the real-time detection polymerase chain reaction assay-its application for clinical use. Hepatology Research， 2001，20(1):84-96.

　　作者单位：1 510275 广东广州，中山大学生命科学学院

　　　　　　　2 510080 广东广州，中山大学达安基因诊断中心

　　(编辑：邓  锋)