点击显示 收起
【摘要】 目的 研究AmpC酶和β-内酰胺酶在阴沟肠杆菌中的表达及其耐药性分析。方法 采用BD BBL Crystal ENF鉴定系统鉴定; 改良酶提取物三维试验;NCCLS推荐的ESBLs表型确证试验;KB纸片扩散法进行药敏试验;聚合酶链反应检测β-内酰胺酶基因型。结果 64株阴沟肠杆菌中,单产AmpC酶、单产ESBLs、同时产AmpC酶和ESBLs的菌株分别占28.13%(18/64)、31.25%(20/64)、39.06%(25/64) 。非产酶型1.56(1/64)。阴沟肠杆菌对碳青霉烯类的亚胺培南和氨基糖苷类的阿米卡星抗菌活性最强,敏感率分别为100%和90.48%。阴沟肠杆菌对β-内酰胺类、氟喹喏酮类、氨基糖苷类的庆大霉素等抗生素都有一定的耐药性。阴沟肠杆菌以痰液标本中检出率为最高84.4%(54/64)。结论 阴沟肠杆菌是医院内感染的常见菌,以呼吸系统感染率为最高。产ESBLs菌株、同时产AmpC酶和ESBLs菌株是导致阴沟肠杆菌多重耐药的重要原因。ESBLs在产AmpC酶菌株中的流行增强了阴沟肠杆菌的耐药性。
【关键词】 阴沟肠杆菌;mpC酶;β-内酰胺酶;耐药性
革兰阴性杆菌产生的β-内酰胺酶(β-lactamases,BLA)种类繁多,特性各异。其中主要为染色体和质粒介导的Ⅰ型AmpC酶和Ⅱ型中的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β -lactamases,ESBLs)。ESBLs的研究已经深入很久,临床治疗和ESBLs的检测已趋成熟,美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)两次明确规定了ESBLs的检测方法及适应被检测的菌种[1,2]。但近年来,高水平表达染色体介导的以及质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶(AmpC酶)逐渐成为临床上所面临的棘手问题。尤其是近年来产AmpC酶的阴沟肠杆菌已逐渐成为引起医院感染的流行菌,其严重的耐药状况备受关注。为此本文对64株阴沟肠杆菌的耐药性及AmpC酶和β-内酰胺酶表达进行了分析,报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
收集自2002年7月~2004年6月昆明市第一人民医院住院及门诊患者感染送检的各类标本中分离出的阴沟肠杆菌64株。按照《全国临床检验操作规程》第2版常规培养分离。菌株采用BD BBL Crystal ENF鉴定系统鉴定。同一患者2次或2次以上检出同一阴沟肠杆菌者仅作一株计算。
1.2 药敏试验
采用Kirby-Bauer纸片扩散法,法国梅里埃公司Mueller-Hinton琼脂、英国OXOID生产的药敏纸片,广东乐通泰公司提供。以大肠埃希菌ATCC25922、产酶型大肠埃希菌ATCC35218作为质控菌株跟随试验,严格按照NCCLS(1999~2004)文件要求和标准进行操作和判读结果。所有质控结果均在NCCLS控制范围内。
1.3 改良酶提取物三维试验[3]
1.3.1 制备酶粗提取物
将细菌制成0.5麦氏浓度菌液,取50μl接种到12ml胰蛋白胨肉汤。置35℃恒温摇床上(200r/min)孵育4~6h,4℃ 4000r/min离心25min,弃去上清液,取沉淀加入0.01 mol/L的PBS(pH7.4) 1.5ml,旋涡混匀,4℃ 12000r/min离心1h,取沉淀物置-170℃液氮反复冻融5次,即为酶提取物。取制备好的酶提取物接种于普通琼脂平板,无细菌生长,-25℃保存。
1.3.2 三维试验(间接法)
将大肠埃希菌ATCC 25922按K-B法涂布MH,在其中央贴FOX(30μg)纸片,用无菌刀片在离纸片边缘5 mm处放射状切1条狭缝,取25~40μl酶提取物加入狭缝内,待稍干后置35℃ 18~24h。若在狭缝与抑菌环的交界处出现扩大的长菌区域,判为AmpC酶阳性。以阴沟肠杆菌阴性菌株029和阳性菌株029M作为质控菌株跟随试验。
1.3.3 ESBLs表型的初筛与确证
法国梅里埃公司Mueller-Hinton琼脂、英国OXOID生产的药敏纸片。在一个MH平板上同时采用NCCLs推荐的纸片扩散法初筛试验、双纸片确证试验和双纸片协同试验三种方法。初筛试验、双纸片确证试验结果判读依照NCCLs文件标准。双纸片协同试验的结果判定参照文献[1]。以大肠埃希菌 ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212、产酶型大肠埃希菌ATCC35218作为质控菌株跟随试验,所有质控结果均在控制范围内。
1.4 主要仪器及设备
超低温高速离心机(德国Heraeus),恒温摇床(培英THZ-D),-170℃液氮,恒温孵育箱。核酸蛋白检测仪:Biophotmeter,eppendorf产品。PCR扩增仪:personal cycler,Biometra产品。电泳仪:BIO-RAD产品 Power PAC 3000。凝胶成像分析系统:BIO-RAD产品 Gel Doc 2000TM。
1.5 ESBLs编码基因检测
1.5.1 引物
TEM、SHV型ESBLs编码基因,参照文献[4]设计引物,blaTEM(序列存取号J01749)F:5’-CGTGTCGCCCTTATTCCC-3’,R: 5’-AGGCACCTATCTCAGCGATC-3’,扩增片段822bp。BlaSHV(序列存取号AF124984) F:5’-ATGCGTTATATTCGCCTGTG-3’,R: 5’-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3’,扩增片段862bp。参照文献[4]设计引物CTX-M(包括CTX-M-1、3、10、11、12)、F:5’-ACAGCGATAACGTGGCGATG-3’,R: 5’-TCGCCCAATGCTTTACCCAG-3’,扩增片段217bp,所有引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
1.5.2 试剂
Taq酶、dNTP、MgCl2、10xPCR Buffer均为上海博亚生物技术有限公司产品。DNA分子量Marker为 Fermentas LIFE SCIENCE 产品: pUC Mix Marker,分子量范围:19~1118bp。 琼脂糖为REGULAR 产品。
1.5.3 PCR扩增反应体系
参照文献[4]进行:10X Buffer 2.5μl、 Mg2+ 1.5mM 1.5μl、dNTP(200uM) 1.0μl、Taq DNA polymerase 1.0u、引物(50pmol) 0.5μl、灭菌去离子水14.5μl,样品DNA 5μl,总体积25μl。
1.5.4 PCR扩增条件
参照文献[4] 设计,blaTEM: 预变性94℃ 3min,变性94℃ 1min,退火60℃ 1min,延伸72℃ 2min,后延伸72℃ 5min,热循环数35。 BlaSHV:预变性95℃ 5 min,变性95℃ 1min,退火57℃ 1min,延伸72℃ 2min,后延伸72℃ 5min,热循环数35。CTX-M:预变性94℃ 3 min,变性94℃ 45s,退火56℃ 45s,延伸72℃ 1min,后延伸72℃ 5min,热循环数32。
1.5.5 PCR扩增产物检测
用2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物,Gel Doc 2000TM凝胶成像分析系统分析判断结果。每组PCR均设阳性及阴性对照,阴性对照株为大肠埃希菌ATCC25922和蒸馏水。阳性对照株为产酶型大肠埃希菌ATCC35218。
1.6 数据分析
文中的数据和表格采用世界卫生组织耐药监测组Thomas O' Brien 和John Stelling提供的WHONET5.0软件进行分析。
2 结果
2.1 阴沟肠杆菌产酶情况分析
64株初筛阳性菌中,产AmpC酶阳性率为87.5%(56/64)。表型筛选产ESBLs的检出率为71.88%(46/64)。产酶种类为:单产AmpC酶28.13%(18 /64),单产ESBLs酶31.25%(20/64),同时产AmpC酶和ESBLs酶39.06%(25/64),非产酶型1.56%(1/64)。不同表型产酶阴沟肠杆菌对抗生素的耐药性,详见表1。表1 不同产酶阴沟肠杆菌对抗生素的耐药性抗生素 总耐药率(略)
2.2 标本种类和来源
2.2.1 种类
痰液标本54株,检出率为84.38%。尿液标本3株,检出率为4.69%。分泌物标本2株、引流液标本1株、浓液标本1株和院内感染监测标本3株。
2.2.2 来源
重症监护室(ICU)24 例,占37.5%。神经外科20例,占31.25%。呼吸科4例,干部科9例,骨科2例,中医科1例,门诊1例,院内感染3例监控标本分别来源于ICU医护人员手指、神经外科桌面和胃镜室空气。
2.2.3 ESBLs编码基因扩增结果
见表2。表2 46株阴沟肠杆菌ESBLs基因扩增结果ESBLs基因(+)27/46 阴沟肠杆菌(略)
3 讨论
AmpC酶在分子结构上具有同源性,属于β-内酰胺酶分子生物学分类中的C类酶,功能分类(Bush-J-M 分类)中的1 组。阴沟肠杆菌在自然状态下野生型菌株的AmpC 酶呈低水平性分泌,甚至不被经典的β-内酰胺酶测定方法所检测到,但在β-内酰胺类抗生素诱导作用下,酶活性可提高100倍左右。此外,在自然状态下阴沟肠杆菌有着高频率的去抑制突变率,突变后完全去抑制型可以比突变前AmpC 酶产量提高1000倍以上。亚胺培南、头孢西丁、替卡西林、克拉维酸都是AmpC 酶的强诱导剂,临床上可由此治疗导致高水平AmpC 酶产生[3]。近年来头孢菌素的广泛使用和其对阴沟肠杆菌的选择作用,使阴沟肠杆菌迅速成为医院严重的感染病原菌,尤其是对免疫力低下的患者。临床分离的阴沟肠杆菌已基本对第一~三代头孢菌素在内的β-内酰胺类、氨基糖苷类的庆大霉素、氟喹诺酮类等抗生素有了较高耐药率[5]。本组药敏中,阴沟肠杆菌对氨苄西林、头孢唑啉和头孢西丁均高度耐药,已无临床应用价值。也提示不宜选用三代头孢、含酶抑制剂复合制剂类、单环类氨曲南等。因为这些药物除了有较高耐药率外,还是AmpC 酶的强诱导剂。
阴沟肠杆菌产β-内酰胺酶主要为染色体和质粒介导的Ⅰ型AmpC酶和Ⅱ型中的ESBLs。两种酶的分子结构和水解底物不同,对相同的抗生素表现出不同的耐药性。从本文的结果可以看出,单产ESBLs菌株的耐药性明显高于单产AmpC酶菌株和产AmpC酶和产ESBLs菌株。这可能与ESBLs对β-内酰胺类抗生素的强选择压力有关,因为其对ESBLs基因的编码区、启动子、拷贝数的改变可明显增加菌株的耐药水平和扩大底物谱。另外,由于ESBLs质粒AmpC酶常携带大质粒,同时编码对其他抗生素的耐药性,表现出对多种类型抗生素的多重耐药复杂性[6]。本文中单产ESBLs菌株在阴沟肠杆菌中占了主要地位,其对第一~三代头孢菌素在内的β-内酰胺类、氨基糖苷类的庆大霉素、氟喹诺酮类的耐药率显著高于后两者;同时产AmpC酶和产ESBLs菌株介导的耐药率也显著高于单产AmpC酶,居第二位;单产AmpC酶菌株的耐药性较前两者低,居第三位。近年来国外[5,7,8,9]报道了由产ESBLs阴沟肠杆菌引起的医院感染,从而证实产生ESBLs是造成阴沟肠杆菌对头孢菌素耐药的另一重要原因。本组实验中ESBLs的高检出率与报道接近[10,11],并且以SHV和CTX-M基因型为主。由此可看出,产ESBLs菌株、同时产AmpC酶和产ESBLs菌株在医院感染中有流行趋势,应引起医务工作者的关注和重视,其高耐药率使得在治疗此类细菌引起的感染时,选择抗生素的范围极为有限。进一步深入研究阴沟肠杆菌的耐药机制迫在眉睫。
另外,本研究显示,治疗阴沟肠杆菌所引起的感染,可首选碳青霉烯类抗生素。虽然它是酶的强诱导剂,但因其有特殊的空间构象,具有很强的抗菌活性,能在诱导产生足量AmpC酶之前快速杀灭细菌。其次,也可以选用氨基糖苷类的阿米卡星等。也可根据药敏实验选用第四代头孢菌素,其能逃避β-内酰胺酶对阴沟肠杆菌的水解,是因为阴沟肠杆菌对β-内酰胺酶的亲和力弱,尤其是由染色体介导的酶[12]。本组产ESBLs菌株、同时产AmpC酶和产ESBLs菌株对头孢吡肟有一定的耐药性,是不是与本院广泛应用头孢吡肟有关,还需进一步深入研究。
从标本种类和来源分析,感染部位以呼吸道感染为最常见,占84.38%,其次为尿液和分泌物,这可能与近年来临床上不断采用新的生物医学技术和治疗方法如支气管镜、心导管等,以及免疫抑制剂和细胞毒性药物治疗等有关。感染严重的科室以ICU为最高,其次为神经外科。这与患者病情严重,抵抗力弱和营养不良、接受侵袭性操作有关。这些普遍存在的易感因素,导致近几年来阴沟肠杆菌感染明显增多。
可见,耐药性成为全球性棘手问题,研究药物对细菌的耐药机制对研制新的有效抗生素是非常必要的。对查清临床流行状况、预防耐药菌株在临床广泛传播、有效治疗其引起的严重感染性疾病、医院感染控制、指导临床正确合理使用抗生素等多方面具有十分重要意义。
【参考文献】
1 陈民均.细菌对β-内酰胺的耐药性及检测方法. 中华检验医学杂志,2001,24:197-200.
2 National Committefor Clinical Laboratory Standards.Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing Fourteenth Informational supplement(M100-S13).
3 Aurine A,Leverstein-van Hall,Ad C.Fluit,et al. Evaluation of the Etest ESBL and BD Phoenix,VITEK 1,and VITEK 2 Automated Instruments for Detection of Extended -Spectrum Beta-Lactamases in Multiresistant Escherichia coli and Klebsiella Spp. Journal of Clinical Microbiology,2002,40(10):3703-3711.
4 Coudron PE,Moland ES,Thomoson KS. Occurrence and detection of AmpC β-lactamase among Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center. J Clin Microbiol,2000,38:1791-1796.
5 顾怡明,张杰.阴沟肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶的基因型调查.中国抗生素杂志,2004,29:2.
6 倪语星,洪秀华.细菌耐性监测与抗感染治疗.北京:人民军医出版社,2002,26-46.
7 Quinteros M,Radice M,Gardella N,et al.Entended-spectrum beta-lacta mases in Enterobacter in Buenos Argentina,public hospitals.Antimicrob Agents Chemother,2003,47(9):2864-2867.
8 Morris D,O'Hare C,Glennon M,et al.Extended-spectrum beta-lacta mases in Ireland,including a novel enzyme,TEM-102.Antimicrob Agents Chemother,2003,47(8):2572-2578.
9 Levison ME,Mailapur YV,Pradhan SK,et al.Regional occurrence of plasmid-mediated SHV-7,an extended-spectrum betalactamase,in Enterobacter cloacae in Philadelphia teaching hospitals.Clin Infect Dis,2002,35(12):1551-1554.
10 余丹阳,刘又宁. AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶在阴沟肠杆菌中的表达及其耐药性的影响.中华医学杂志,2002,82-19.
11 Tzelepi E,Giakkoupi P,Sofianou D,er al.Detection of extendedspectrum β-lacta mases in clinical isolates of Enterobcter cloacae and Enterobacter aerogenes.J Clin Microbiol,2000,38:542-546.
12 陈百义.马斯平药理学特征及其治疗地位.中国医学论坛报,2005,5,12(24).
基金项目:昆明市科技局2003年重点科技计划项目(昆科计字:03A440114)
作者单位:650011 云南昆明,昆明市第一人民医院,昆明临床疾病分子生物学重点实验室
(编辑:石 岚)