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【摘要】 目的 研究吸烟者树突状细胞（DC）的功能。方法 分离吸烟者和非吸烟者外周血单个核细胞（PBMC），在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素4（IL-4）的培养条件下制备DC。流式细胞仪检测DC表面CD86的表达；混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC对T淋巴细胞的刺激能力；酶群免疫吸附法（ELISA）测定MLR上清液中细胞因子水平。结果 与非吸烟者比较，吸烟者DC表面CD86的表达明显增高，对T淋巴细胞的刺激能力增强；致炎细胞因子（IL-1β）分泌增多，抑炎因子（IL-10）分泌减少。结论 吸烟者DC明显激活，可能是吸烟致动脉粥样硬化的机制之一。
【关键词】 吸烟；树突状细胞；细胞因子；动脉粥样硬化
Analysis of function of dendritic cells in smoking person
L Yong-heng，LI Zhi-liang，SHI Xiang-dong.Department of Cardiology，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhong 510287，China
【Abstract】 Objective To investigate the function of dendritic cells （DCs） in smoking person.Methods DCs were derived from human periphery blood monocyte cells （PBMCs） upon culture with interleukin-4 （IL-4） and granulocyte macrophage colony stimulating factor （GM-CSF） from smoking person.The surface co-stimulatory factor CD86 （7-2） of DCs were assessed by flow cytometry.Immunostimulatory capacity was measured by mixed lymphocyte reaction （MLR）. ELISA was used to analyze the level of cytokines （IL-1β，IL-10）.Results Much more CD86 was expressed on DCs from smoking person.The stimulating capacity of DCs in MLR was higher，and the T lymphocytes in MLR produced higher levels of pro-inflammation cytokines and lower levels of restrin-inflammation cytokines，compared with normal group.Conclusion DCs of smoking person are activated，which may play an important role in the progress of atherosclerosis （AS）.
【Key words】 smoking;dendritic cells;cytokines;atherosclerosis
近年发现免疫炎性反应在促进动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发病中起重要作用［1］。研究发现体内功能最强的专职性抗原提呈细胞树突状细胞（dendritic cell，DC）在AS斑块中聚集增多，提示其所介导免疫炎性反应参与了AS的发生和发展［2］。吸烟是心脑血管疾病的重要危险因素之一［3］，有观察表明吸烟可激活体内的炎性反应［4］，但吸烟是否影响DC功能从而促进AS的发生与发展，目前尚少有报道。本文通过观察吸烟者DC的功能状态，进一步阐明吸烟致AS的可能机制。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选取吸烟和非吸烟者各30例，两组年龄、性别等无明显差异。所有对象均排除急慢性炎性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤，未用激素及免疫抑制剂。
1.2 材料 RPMI1640（L-glutamine）培养基、胎牛血清（FCS）购自Gibco公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；四唑盐（MTT）、二甲亚砜（DSMO）购自广州威佳公司；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）购自英国Peprotech公司；PE标记的鼠抗人CD86（B7-2）单抗购自Biolegend公司；白细胞介素-1β（IL-1β）、白介素-10（IL-10）ELISA试剂盒购自美晶公司。
1.3 方法
1.3.1 DC制备 抽取受试者外周血20ml，淋巴细胞分离液中离心（2000r/min，20min），收集单个核细胞（PBMC），PBS冲洗2次，RPMI 1640冲洗1次，用完全RPMI 1640（含10%FCS）在6孔培养板中培养2h（37℃，5%CO2），去掉非贴壁细胞。贴壁细胞用完全RPMI 1640（含10%FCS、rhGM-CSF 100ng/ml、rhIL-4 500u/ml）培养液，置37℃、5%CO2温箱中培养7天，隔天半量换液1次。收集培养第7天的悬浮细胞即DC进行实验。
1.3.2 DC形态 于培养第1、3、5、7天在倒置显微镜下观察DC形态。
1.3.3 流式细胞学分析 收集DC细胞，用PE标记的CD86（B7-2）单抗标记细胞，用流式细胞仪（FACS，美国Becton Dickinson）检测。
1.3.4 混合淋巴细胞反应（MLR） 反应中淋巴细胞来自其他健康供血员的PBMC，经T细胞尼龙毛柱分离后，得到纯的T淋巴细胞。浓度为2×105/ml的T淋细胞与浓度为2×104/ml的DC各100μl在96孔平底培养板中37℃、5%CO2条件下混合培养，第4天吸取上清液-20℃保存待测细胞因子，沉淀细胞加MTT液（25μl/孔），继续培养4h后每孔加DMSO 100μl，波长570nm处测A值。
1.3.5 细胞因子测定 酶联免疫吸附法（ELISA法）分别检测保存的混合淋巴细胞反应上清液IL-1β和IL-10浓度，操作严格按试剂盒说明进行。
1.4 统计学方法 应用SPSS 10.0软件系统分析，所有资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异用t检验（Independent-Samples T test）。P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 DC形态学特点 光学显微镜下可见细胞表面伸出树突样结构，长短不一，呈簇状生长，为典型的DC细胞。吸烟者和非吸烟者DC在形态上无差别。
2.2 吸烟者DC的功能 吸烟者DC表面CD86表达明显高于非吸烟者（P＜0.001），吸烟者DC刺激T淋巴细胞增殖能力显著高于对照组（P＜0.001）。如表1所示。
表1 吸烟者DC功能 （略）
2.3 细胞因子测定 吸烟者MLR上清液中促炎细胞因子IL-1β显著高于对照组，而抑炎细胞因子IL-10低于对照组，如表2所示。
表2 MLR上清液中细胞因子浓度 （略）
3 讨论 近年研究证明，动脉粥样硬化（AS）为一炎性疾病［1］，在AS斑块中有大量免疫炎性细胞如T淋巴细胞、巨噬细胞等［5］。DC是体内效应最强的专职性抗原呈递细胞，其激活T淋巴细胞的能力是巨噬细胞或B细胞的100～1000倍，T淋巴细胞必须与之接触才能被激活［6］。Bobryshev等［7］发现AS斑块中DC亦聚集增多，认为DC介导的免疫炎性反应可能参与了AS的发病。吸烟是心血管事件的危险因素［3］，烟雾的重要成分尼古丁可通过损伤血管内皮、干扰脂代谢、激活凝血系统等参与AS的发生和发展过程［8］。有观察表明吸烟与系统中的炎性标志物相关［4］，Aricher等［9］报道尼古丁在体外具有强烈的激活DC的作用，提示吸烟可能影响机体免疫炎性反应。本文研究结果表明，吸烟者DC处于激活状态，表现为表面共刺激因子CD86表达明显升高，对T淋巴细胞的促增殖作用加强，T淋巴细胞分泌促炎因子增多，而抑炎因子分泌减少。由于DC的激活，其所介导的免疫炎性反应受到增强，加重了对血管壁的损伤，AS斑块的不稳定性增加，从而导致了AS的发生与发展。因此，可以认为吸烟对DC的激活作用是其导致AS的机制之一。
【参考文献】
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9 Aricher A，Heeschen C，Mohaupt M，et al.Nicotine strongly activates dendritic cell mediated adaptive immunity:potential role for progression of atherosclerotic lesion.Circulation，2003，107:604-611.
作者单位： 510282 广东广州，南方医科大学珠江医院心内科
（编辑：汪 洋）