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【摘要】 目的 探讨利用混合酶消化法从溺死者肺、肝、肾、脾等脏器中检出硅藻，为区别生前溺水死亡或死后抛尸入水提供科学依据。方法 通过动物实验制作溺死脏器样本，通过单一酶消化选出几种消化能力强、价格便宜的酶，将几种酶按比例混合进行脏器消化。同时进行强酸化学消化法对比。结果 肺脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅰ、蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；肝脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅱ、蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；肾脏的最佳消化组合酶为蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；脾脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、蛋白酶K和透明质酸酶。结论 混合酶消化法检验溺死脏器中硅藻在速度、安全性、环保、检出率等方面均优于强酸消化法，应在公安刑事科学技术范围内推广使用。
【关键词】 混合酶；消化；硅藻；溺死
An experimental study on detection of diatom in drowning organ of bodies by multi-enzymatic digestion method
HE Guan-ying, ZHANG Wei-dong, WANG Guo-lin, et al Liaoning Province Criminal Science and Technology Institute, Shenyang 110033，China
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to evaluate the reliability and applicability of quantitative and qualitative diatom analysis by multi-enzymatic digestion method in the diagnosis of drowning organ of bodiesMethods This study included beforehand samples , normal control samples , control samples of experiment and experimental samples Organ samples were treated by both chemical and multi-enzymatic methods, the first one using concentrated nitric acid and the second conglomerate of several enzymeResults The conglomerate of collagenase I, proteinase K, hyaluronidase and trypsin is best in digesting lung than other The conglomerate of collagenase Ⅱ, proteinase K, hyaluronidase and trypsin is best in digesting liver kidney than other The conglomerate of collagenase I, collagenase Ⅱ, hyaluronidase and trypsin is best in digesting spleen than other The number of diatoms recovered with multi-enzymatic digestion method was more than chemical method, and the rate of detection is higherConclusion Our experience was that the multi-enzymatic method seemed to be more excellent in terms of rapidity, safety and environmental protection than chemical digestion The authors suggest that diatom analysis using multi-enzymatic digestion of organs can be used as a criterion for positive diagnosis of drowning in cases involving putrified bodies, and should expand the usage within the scope of criminal science and technology
【Key words】 multi-enzyme；digestion；diatom；drowning
在溺死案例中，硅藻随溺液进入肺泡内，并通过肺泡壁毛细血管进入大循环，到达全身各器官。检查脏器中的硅藻，是诊断生前溺水死亡较为可靠的方法。对溺死尸体进行硅藻检验大约始于19世纪末，至今已有一百多年的历史［1］。1904年，Revenstorf［2］首次报道了依据硅藻检验方法诊断溺死的案例。近几十年来，很多学者对硅藻的检验方法进行了探索和创新，但各种方法均有不足之处。目前普遍采用的是用化学（强酸、强碱）消化法进行检验，该方法危险性高，安全性差，对环境污染大，操作复杂，检出率较低。本项研究对实验性溺死大鼠脏器中的
硅藻进行混合酶消化法检验，针对脏器中组成成分所占比例不同，选择不同的组合酶来进行消化。经过反复摸索和实践，最终确定了该方法的操作规程。此硅藻检验新方法的确立，大大提高硅藻的检出率和硅藻种类的检出范围。
1 材料与方法
11 实验动物 中国医科大学动物部提供的成年健康清洁级SD大鼠20只，雌雄不限，平均体重300±15g，适应性饲养3天。室温：25±2℃，湿度：(30±2)％。
12 主要仪器和试剂 常用仪器为离心机、恒温箱、显微镜和破机罐等。试剂选用了胃蛋白酶（上海化学试剂公司）、胰蛋白酶（美国Difco）、蛋白酶K（德国Merck）、胶原酶/分散酶（美国Roche）、胶原酶I、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶（美国Roche）和糜蛋白酶（上海化学试剂站分装厂）等。
13 实验方法
131 动物分组 随机分成4组，预试验组8只（A组），溺死于含已知硅藻种类的水中，溺死过程为5min；正常对照组4只（B组），断颈处死；实验组对照组4只（C组），断颈处死后投入含已知硅藻种类的水中；实验溺死组4只（D组），溺死于含硅藻土的水中，溺死过程为5min。
132 操作步骤 分别取各种脏器1g剪碎后置于10ml试管中，加入TES［取2M Tris-HCl（pH=75） 5ml，05M EDTA 10ml，5M NaCl 20ml,加灭菌蒸馏水1000ml。终浓度：10mM Tris，100mM NaCl,5mM EDTA］缓冲液3ml、SDS(十二烷基硫酸钠，10%)溶液03ml和选用的酶溶液200μl，置45℃恒温箱内观察3～6h，待液体近透明（无明显固体）时，加入3ml蒸馏水，混匀后离心、去上清涂片镜检。
133 强酸消化法 取B组、C组和D组大鼠的肺脏、肝脏、肾脏及脾脏等脏器，按文献报道所示步骤进行消化［2］。
134 酶选择实验 笔者应用了市面上常见且价格合理的8种生物酶进行了选择性试验，取A组大鼠的各种脏器，剪碎后分别加入有标记的试管中，每只试管加入一种酶（浓度暂定为20mg/ml），按132所示步骤进行消化。
135 消化灵敏度实验 按134步骤将选择后酶的浓度分成40mg/ml、20 mg/ml、10 mg/ml和5 mg/ml，取A组大鼠的肝脏、肺脏、脾脏及肾脏，按132所示步骤进行消化。
136 酶组合消化脏器试验 取B组、C组和D组大鼠的肝脏、肺脏、脾脏及肾脏等，根据134和135的结果选择几种酶类配制一定浓度后按132所示步骤进行消化。
2 结果
通过肉眼观察，将各种酶的消化能力分成4级，分别用罗马数字Ⅰ～Ⅳ级表示。Ⅰ级表示消化能力最强，Ⅳ级表示消化能力最弱，具体意义如下：Ⅰ级：液体中可见少许固体物质，约10％；Ⅱ级：液体中剩约25％的固体物质；Ⅲ级：液体中剩约50％的固体物质；Ⅳ级：液体中剩约75％的固体物质。
21 酶选择试验 见表1。从表1中可以看出：(1)肺：胰蛋白酶、蛋白酶K和胶原酶的消化能力均达到Ⅰ级，胶原酶/分散酶和透明质酸酶消化肺脏的消化能力可达到Ⅱ级；(2)肝：蛋白酶K和胶原酶Ⅱ的消化能力均达到I级，胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和透明质酸酶的消化能力均达到Ⅱ级；(3)肾：胰蛋白酶的消化能力达到Ⅰ级，蛋白酶K、胶原酶/分散酶和透明质酸酶的消化能力均达到Ⅱ级；(4)脾：蛋白酶K的消化能力达到Ⅰ级，胰蛋白酶、胶原酶/分散酶、胶原酶Ⅱ和透明质酸酶消化脾脏的消化能力均达到Ⅱ级。表1 8种蛋白酶消化能力的对比
22 消化灵敏度实验 见表2。从表2中可以看出：(1)胃蛋白酶仅在40mg/ml浓度时，消化肺、肝可达到Ⅱ级水平，其消化能力较低。不作为选用酶。(2)胰蛋白酶在10mg/ml浓度时，消化肺、肾就达到Ⅱ级水平，在20mg/ml浓度时，消化肝、脾也达到了Ⅱ级水平，可作为选用酶。(3)蛋白酶K在10mg/ml浓度时，消化肺、肝和脾就达到Ⅱ级水平，在20mg/ml浓度时，消化肾也达到了Ⅱ级水平，可作为选用酶。(4)胶原酶/分解酶在20mg/ml浓度时，消化肺、肾和脾才达到Ⅱ级水平，其消化能力则较低，不作为选用酶。(5)胶原酶I在10mg/ml浓度时，消化肺脏就达到Ⅱ级水平，对其他脏器的消化能力较低，可作为消化肺脏组合酶的选用酶。(6)胶原酶Ⅱ在10mg/ml浓度时，消化肝脏就达到Ⅱ级水平，对其他脏器的消化能力较低，可作为消化肝脏组合酶的选用酶。(7)透明质酸酶在10mg/ml浓度时，消化肺、肝、肾、脾均达到Ⅱ级水平，可作为选用酶。(8)糜蛋白酶仅在40mg/ml浓度时，消化肺、肾才达到Ⅱ级水平，其消化能力较低。不作为选用酶。 表2 不同浓度生物酶消化能力的对比
23 混合酶消化组合选择实验 通过肉眼观察，将混合生物酶的消化能力分成四级，分别用Ⅰ-α，Ⅰ-β，Ⅱ-α，Ⅱ-β表示。Ⅰ-α级表示消化能力最终，Ⅱ-β级表示消化能力最弱，具体意义如下：Ⅰ-α级：液体中几乎不含有固体物质，近透明状态；Ⅰ-β级：液体中剩约10%的固体物质；Ⅱ-α级：液体中剩约20%的固体物质；Ⅱ-β级：液体中剩约30%的固体物质。从表3中可以看出：(1)肺脏的最佳消化组合酶为胶原酶１、蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；(2)肝脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅱ、蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；(3)肾脏的最佳消化组合酶为蛋白酶K、透明质酸酶和胰蛋白酶；(4)脾脏的最佳消化组合酶为胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、蛋白酶K和透明质酸酶。 表3 多种生物酶组合消化各脏器消化程度比较 注：(1)所用酶类及相关试剂，为了方便标记，各试剂简写如下：C/Ⅰ:胶原酶Ⅰ Collagenase Ⅰ 10mg/ml；C/Ⅱ:胶原酶Ⅱ Collagenase Ⅱ 10mg/ml；PK:蛋白酶K Proteinase K 10mg/ml；Hy:透明质酸酶 Hyaluronidase 10mg/ml；Try:胰蛋白酶 Trypsin 10mg/ml； (2)基本条件:底物组织均1g，酶终浓度约1mg/ml，温度45℃～55℃，消化时间3～6h
24 酶消化法同强酸消化法的对比 将混合酶消化法和化学消化法的涂片随机选取10个高倍视野进行观察硅藻的种类和数量，取平均值，见表4。从表4中可以看出：混合酶消化法的检验结果从种类和数量上均高于化学消化法，从溺液、肺、肝、肾、脾这5项指标来看，前者的检出种类为后者的2～3倍；前者的检出数量为后者的26～75倍。混合酶消化法从肺和肝中的硅藻检出率较高，可达到80％以上；从肾中的硅藻检出率为57％；而从脾脏中硅藻的检出率最低，仅为41％。表4 混合酶消化法和化学消化法检出硅藻结果的对比
3 实际案例应用
(1)2004年3月5日，在辽阳市某湖水中发现一无名男尸，经查死者系张某（男，29岁），为一名出租车司机。出租车停在湖旁路边，尸检未发现损伤痕迹。提取死者肝、肾、肺组织，送本室进行硅藻检验。经混合酶消化法检查，在死者肝、肾和肺脏中均检出了与现场水样一致的硅藻成分，为案件的定性起到了关键性作用。
(2)2004年8月26日，在海城市一鱼塘内发现一无名女童尸体，经查死者为丛某某（女，8岁），于本月12日失踪。因现场被破坏，且尸体高度腐败，尸检时未发现有价值的痕迹，故难以确定死亡原因和案件性质。经采用混合酶消化法检查，在死者肝、肾和肺脏中均检出了与现场水样一致的硅藻。从而为确定死亡原因及案件的定性起到了至关重要的作用。
(3)2005年3月8日，在盘锦市某湖内发现一无名女尸。因现场被破坏，且尸体高度腐败，尸检时未发现有价值的痕迹，故难以确定死亡原因和案件性质。经采用混合酶消化法检查，在死者肝、肾和肺脏中均检出了与现场水样一致的硅藻。从而为确定死亡原因及案件的定性性质起到了重要的作用。
(4)2005年4月18日，在兴城市某河内发现一无名男尸，经查死者为徐某某（男，34岁），因现场被破坏，且尸体高度腐败，尸检时未发现有价值的痕迹，故难以确定死亡原因和案件性质。经采用混合酶消化法检查，在死者肝、肾和肺脏中均检出了与现场水样一致的硅藻。从而为确定死者死亡原因及案件的定性提供了方向。
4 讨论
硅藻又称微藻，属藻类中金藻门硅藻纲，下分二目，即中心硅藻目和羽纹硅藻目，广泛存在于自然界的单细胞生物，水中含量最为丰富（海水中以中心硅藻目为主，淡水中以羽纹硅藻目为主）。硅藻由细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核组成。直径多在8～15μm，只有借助显微镜才能看到。形状多种多样，细胞壁由纤维素组成，结合有二氧化硅和碳酸钙，具有很强的抵抗能力，不能被生物酶类消化［3，4］。本研究结果表明，混合酶消化法检出的硅藻种类和数量均高于单一酶消化和化学消化法。
在已建立的检验硅藻多种方法中，浸渍法方法简单，但检出率不高，往往不能达到满意的效果。化学消化法是一种检查耐酸、碱硅藻的方法，安全性差，污染环境。焚灼法操作难度大，危险性高。DNA分析法能准确测定硅藻的类型及是否同一，但成本较高，技术也较复杂。Soluene-350凝胶法适合淡水中的硅藻检验，但操作复杂，不适合基层单位使用［5～12］。从本实验结果可以看出，混合生物酶消化法能够克服上述种种的缺点和不足，操作简单，使用方便，不需要复杂的仪器设备，是简单、准确、安全、科学且最适合基层实际办案的硅藻检验新方法。
通常只有生前溺死者的脏器组织中才能发现硅藻（除肺脏外）。死后抛尸入水者以及水中猝死者，硅藻均无法进入体循环而到达各脏器。使用混合酶消化法检验生前溺死时的原则是：凡两种以上脏器组织硅藻检验阳性，且硅藻种类与现场水样一致的情况下，即可判定为生前溺死。但此时需要确认在提取脏器和硅藻检验的全过程中没有外界污染。同样，硅藻检验阴性时否定生前溺死也必须确认检验操作准确无误，操作过程没有过多的破坏或消耗，同时现场水样中硅藻数量较多，而且没有水中急死或其他死因存在时，才能判定死后入水［13～15］。
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作者单位： 110031 辽宁沈阳，辽宁省刑事科学技术研究所
基金项目：辽宁省公安厅科研基金资助项目（编号：2003A007）
(编辑：石 岚)