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【摘要】 目的 体外诱导扩增小鼠骨髓来源树突状细胞（DC），并从形态、表面分子和功能三方面进行鉴定。方法 无菌取骨髓细胞培养4h后，除去悬浮细胞，然后加入rmGM-CSF和rmIL-4培养，7天后观察DC的形态特征，流式细胞仪（FACS），检测DC表面分子及混合淋巴反应(MLR)，检测DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 培养出的DC具有大小不一的突起，表达小鼠DC特异的表面标志33D1，及表面分子CD40、CD80和CD86；具有强烈刺激同种异体T细胞增殖的能力，且随DC数目的增多而增强。结论 从小鼠骨髓细胞中扩增出大量具有典型特征的DC，为后续研究奠定基础。
【关键词】 树突状细胞；骨髓细胞；混合淋巴反应
Amplification and identification of dendritic cells derived from mouse bone marrow in vitro
SUN Yun,YANG Ji-yao,WU Jian-qing,et al.Life Scientific College of Nanjiang Normal University,Jiangsu 210097,China
【Abstract】 Objective To induce and amply dendritic cells (DCs) from mouse bone marrow in vitro, and identify from their morphology，surface molecules and function. Methods Isolated mouse bone marrow cells were cultured 4 hours, then removed suspended cells and added rmGM-CSF and rmIL-4.After 7 days, DCs morphological characterization was observed, the expression of the surface molecules was examined by fluorescent activated cell sorter(FACS), DCs’ power to stimulate the proliferation reaction of allogeneic T cells was detected with mixed lymphocytes reactivation(MLR).Results Cultured DCs had longer or shorter dendrites ;expressed mouse special marker 33D1 and surface molecules including CD40,CD80,CD86;and intensely stimulated the proliferation of allogeneic T cells, What’s more, the power of proliferation was enhanced with the increase of numbers of DCs.Conclusion Obtain a lot of DCs had typical characterization from mouse bone marrow, and establish foundation for further studies.
【Key words】 dendritic cells; bone marrow cells; mixed lymphocytes reaction
树突状细胞（dendritic cell, DC）可以识别、摄取、加工和处理外来抗原，激活T细胞诱导机体初次免疫应答，调节T、B细胞介导的免疫应答和诱导对自身抗原的免疫耐受［1～3］。近年来，对DC的研究已经成为多种疾病免疫治疗的热点。为获得大量DC以满足实验的需要，本研究从小鼠骨髓细胞中定向诱导出具有典型形态、经表型和功能鉴定无误的DC，为基于DC的后续研究提供依据。
1 材料
1.1 动物 BALB/C小鼠，4～6周，雄性，购自中国科学院上海实验动物中心。ICR小鼠，6～8周，雄性，购自江苏省实验动物中心。
1.2 主要试剂 重组小鼠GM-CSF（rmGM-CSF）和重组小鼠IL-4（rmIL-4）（R＆D system）；FITC荧光标记的大鼠抗小鼠CD86、CD80、CD40单抗及抗小鼠的DC特异表面标志33D1单抗（eBioscience）；FITC荧光标记的山羊抗大鼠IgG单抗（北京中山生物公司）；伴刀豆球蛋白(ConA)（Sigma）；丝裂霉素C（Kaowa Hakko Kogyo）；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)试剂盒（Promega）。
2 方法
2.1 骨髓DC的分离培养 参照文献方法［4］，略有改动。拉颈处死BALB/C小鼠，无菌剥离股骨和胫骨。用注射器将骨髓冲出，离心收集骨髓细胞，加入预温的0.83%Tris-NH4CL裂解红细胞，然后用含10%FCS的RPMI1640完全培养液调细胞浓度1×106/ml，接种于24孔培养板。置37℃,5%CO2的孵箱中培养4h后弃去悬浮细胞，并加入含rmGM-CSF（1000u/ml）和rmIL-4（500u/ml）的完全培养液。至第3天，更换含相同浓度细胞因子的完全培养液。至第5天，半量换液，并补足细胞因子。至第7天，轻轻吹打收集所有的悬浮细胞，即为体外扩增的小鼠骨髓来源的树突状细胞。每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。
2.2 DC表型检测 收集培养至第7天的DC，调细胞浓度为2×105/ml，分别加入1μl FITC标记的大鼠抗小鼠的CD86、CD80、CD40单抗和大鼠抗小鼠的DC特异表面标志33D1单抗。设立空白对照。4℃避光反应30min。然后在加入DC特异表面标志33D1的管中再加入2μl FITC标记的山羊抗大鼠IgG，4℃避光反应30min。洗涤后上流式细胞仪检测。
2.3 混合淋巴细胞反应（MLR） 无菌取ICR小鼠的脾脏细胞过尼龙毛柱，得到的T细胞即为反应细胞，用终浓度为25μg/ml的丝裂霉素C处理DC作为刺激细胞，调细胞浓度为4×105/ml、刺激细胞与反应细胞按1:5、1:10、1:20、1:50的比例加入96孔板。每个3复孔，终体积为200μl。并设立ConA阳性对照、T细胞对照及空白对照。置于37℃，5%CO2孵箱继续培养96h。在培养结束前4h，每孔加入20μl MTS溶液。培养结束后用酶标仪读490nm时每个孔的吸光值。结果以3孔均值表示。
3 结果
3.1 DC的生长情况 培养4h后可见细胞体积小、圆形贴壁，均匀分布，第2天可以看到少量悬浮细胞，除去后可看到大量的点状细胞集落；至第4天可见细胞集落明显增多、增大。再继续培养可见细胞体积明显增大且形态不规则，有3～10个大小不等的毛刺状突起，呈现特征性的星状、树突状；至第7天，大量细胞从集落脱离、悬浮，但也有些稍微贴壁，轻轻吹打即可脱壁。
3.2 DC的表型 流式细胞仪检测表明，培养的DC表达小鼠DC特异性的表面标志33D1，阳性率为53.64%，表达表面分子CD40、CD80和CD86，阳性率分别为71.34%、54.13%、61.67%。
3.3 刺激同种异体T细胞增殖的能力 MLR显示DC能强烈诱导同种异体的T细胞增殖，且促增殖能力随着DC数目的增加而增强。在DC:T细胞比分为1:5、1:10、1:20、1:50时刺激能力（A490）分别为1.74、1.53、1.42和0.84。
4 讨论
DC是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞（APC），是体内唯一能激活初始T细胞反应的APC，在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用。DC广泛分布于血液、肝、脾脏、淋巴结及其他非免疫器官组织中，但含量很少，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5%～1.0%，难以与其他细胞分离纯化。直接从外周血或组织中分离不仅操作复杂，且细胞得率很低。因此，体外扩增DC是研究的必经之路。
自从Inaba［5］用rmGM-CSF体外诱导扩增小鼠骨髓DC以来，人们逐步建立并完善了多种培养扩增DC的方法。如从脐带血、外周血干细胞、外周血单核细胞中诱导分化出DC。尽管不同的前体细胞扩增DC的方法各不相同，但GM-CSF是必不可少的。它可以诱导DC前体增殖分化，并可在体外维持DC的存活。而IL-4可抑制粒细胞和巨噬细胞增生，有利于向DC分化。本研究用rmGM-CSF和rmIL-4这两种细胞因子诱导骨髓细胞定向分化成DC，同时根据DC和单核细胞粘附程度的不同，用手筛法除去悬浮细胞，既降低了成本，得到了足够用的DC，而且也保证了DC的纯度。
鉴定细胞是否为DC，一般根据形态学、组合型标志和刺激同种异体T细胞的增殖能力这三个方面来判断。除了具有许多树突样的突起这一典型特征外，其表面还表达CD40、CD86、CD80、ICAM等分子；能刺激初始T细胞的活化增殖，具有这些特征的细胞方能称为DC［6］。目前，有一些DC特异的表面标志已经得到公认［7］，如小鼠表面的33D1和NLDC145，大鼠的OX62及人DC表面的CD1a和CD83。本研究不但在显微镜下观察到细胞呈现大小不一的树突；同时采用了小鼠特异的表面标志33D1和CD80、CD86、CD40这三种DC表面分子作为标记物，其中CD80、CD86是为T细胞活化提供第二信号通路必须的共刺激分子；CD40可以与T细胞表面的受体结合，导致T细胞的活化。FACS检测显示培养的DC表达较高水平的33D1及3种表面分子，表明DC具有了刺激T细胞增殖的能力；而MLR则证实了DC的确可以强烈刺激同种异体的T淋巴细胞的增殖，并且刺激能力随着DC数目的增多而增强。综合这三方面，可以认定所培养出来的细胞正是DC。本研究从小鼠骨髓细胞中分化出大量DC，并且操作相对简便，为进行下一步研究奠定了基础。
【参考文献】
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4 丁传林，姚堃，张天泰，等.IL-4对DC产生IL-12影响的研究.上海免疫学杂志, 2003, 23: 248-251.
5 Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with grannulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med, 1992, 176: 1693-1702.
6 Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol, 1991,9:271-296.
7 Banchereau J,Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998, 392: 245-252.
作者单位： 1 210097 江苏南京，南京师范大学生命科学学院
2 450052 河南郑州，郑州大学组织学与胚胎学教研室
3 210029 江苏南京，南京医科大学第一附属医院
(编辑：汪 洋)