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【摘要】 目的 检测纳米活性炭（ACNP）对丝裂霉素（MMC）的遗传毒理及生殖毒理学效应的影响。方法 采用小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核试验、中国仓鼠肺细胞（CHL）染色体畸变试验及致畸试验对受试物ACNP-MMC进行遗传毒性及致畸性检测。结果 游离丝裂霉素腹腔注射0.15625～2.5μg/kg 均可导致小鼠骨髓微核试验阳性率和CHL染色体畸变率，用纳米活性炭吸附MMC后给药，在0.625～20.0μg/kg 腹腔注射后都没有明显增加微核试验阳性率和染色体畸变率。结论 ACNP-MMC可以明显减小MMC的遗传毒性和生殖毒性。
【关键词】 纳米活性炭；丝裂霉素；微核试验；染色体畸变试验；致畸试验
Effects of ACNP on the genotoxicity and teratogenicity of mitomycine
MA Shu-zheng,ZHANG Ying-ge.Maternal and Children Healthy Science Institute Pingdingshan,Henan 467000,China
【Abstract】 Objective To study the effects of active carbon nanoparticles （ACNP） on the genotoxicity and teratogenicity of mitomycin C.Methods Using PCE micronuclear test, Chinese hamster lung cell chromosome aberration experiment and rat teratogenicity, to observe the toxicity of free MMC and the MMC absorbed onto ACNP on heredity and reproduction. Results Free MMC 0.15625～5.0μg/kg significantly increased the positive rate of PCE micronuclear test, the chromosome aberration rate and rat teratogenecity, but the mitomycine C absorbed onto ACNP did not increased these heredity and proliferation toxicological indexes in a dose range of 0.625～10.0μg/kg.Conclusion ACNP-MMC have significant effects to decrease the genotoxicity and teratogenicity effects of mitomycine C.
【Key words】 active carbon nanoparticles; mitomycine; micronusclear test;teratogenicity test;chromosome aberration
纳米活性炭（active carbon nanoparticles, ACNP）吸附丝裂霉素C（mitomycine C, MMC）是近来为胃癌腹腔化疗和淋巴化疗而设计的一种新型制剂（ACNP-MMC），可用于胃癌、头颈部肿瘤及宫颈癌等恶性肿瘤的治疗，在实验动物［1］和临床上都已表现出良好的疗效［2～5］。但MMC为一种染色体断裂剂，它作用于细胞之后会使染色体DNA发生损伤并产生微核，具有一定的遗传和生殖毒性。纳米粒子对药物的吸附，会导致药物在体内或细胞内分布的改变，甚至对药物的作用性质发生影响［6］。有关ACNP的动物体内分布研究发现ACNP在雄性大鼠的睾丸有分布（待发表资料）。ACNP吸附MMC后，可以使MMC在体内集中分布于ACNP所存在的器官或组织，提示ACNP在睾丸的分布，有可能造成MMC在生殖器官中的高浓度分布，因此，ACNP-MMC会不会具有遗传和生殖毒性，是其在抗恶性肿瘤应用中所需要注意的一个问题。本文采用小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核试验、中国仓鼠肺细胞（CHL）染色体畸变试验及致畸试验对受试物ACNP - MMC对其所吸附的MMC的遗传毒性及生殖毒性的影响进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料 纳米活性炭（active carbon nanoparticles, ACNP），由军事医学科学院纳米药理毒理学重点实验室提供。丝裂霉素C（MMC, 日本KHK公司）; 环磷酸胺（CP, 上海市12制药厂）;代谢活化剂S9（购自北京中国药品生物制品鉴定所）;1640培养液（GIBCO美国）。中国仓鼠肺细胞（CHL ），由中国军事医学科学院卫生毒理室提供。昆明种小白鼠，体重20～24g，雌雄各半，致畸试验体重为29～35g,由军事医学科学院动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 ACNP-MMC制备 ACNP 1000mg 加入100ml生理盐水中，超声振荡制成混悬液；称取MMC 500mg 加入混悬液中，在超声振荡条件下吸附10min,静置备用。临用前再次超声振荡。
1.2.2 小鼠骨髓PEC微核试验 将小鼠100只随机分为11组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组给予生理盐水, 游离对照组MMC 5个剂量组，分别用游离MMC 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625mg/kg腹腔注射。ACNP-MMC药组按MMC 10，5，2.5, 1.25, 0.625 mg/kg，一次性腹腔给药，24h后断颈处死小鼠，取双侧股骨骨髓细胞制成悬液，离心（1000r/min），弃上清液，将沉淀涂片。干燥后，甲醇固定10～15min，空气干燥。Giemsa染色。
1.2.3 CHL染色体畸变试验 最高剂量以50细胞生长抑制浓度为基准，依次等倍量稀释，共4个剂量。ACNP-MMC（以其中MMC剂量计）试验组分为高级别剂量组（HD）:12.5μg/ml, 6.25μg/ml,3.125μg/ml和游离对照等剂量组（CD）:2.5μg/ml、1.25μg/ml和0.625μg/ml（-S9）。游离MMC对照三个组：2.5μg/ml、1.25μg/ ml和0.625μg/ml（-S9）。另有阳性对照组CP为40pg/ml（+S9）。将5×106 CHI细胞接种于25ml培养瓶中，培养24h后，分别加入不同浓度的ACNP-MMC。无S9时，ACNP-MMC与细胞作用24h及48h后、分别收获细胞制片。有S9时，药物、S9混合液与细胞共同作用7h后，将液体倒掉，用PBS（pH 7.2）洗涤细胞3次，加入新培养液继续培养24h及48h后，分别收获细胞制片,Giemsa染色。同一试验组选择100个分散良好的中期分裂相，在油镜下进行染色体畸变分析，观察染色体有无断裂、缺失、易位、互换、环多倍体等。上述2项试验在同样条件下共检测2次。
1.2.4 致畸试验 将雌雄小鼠按2:1合笼，随后将精子阳性雌鼠随机分成5组，每组至少有孕鼠15只以上（阳性对照组例外，因给药后部分孕鼠流产和早产） 阴性对照组，给等体积生理盐水腹腔注射。阳性对照组，怀孕第10天一次性腹腔注射环磷酰胺30mg/kg。游离MMC 5个剂量组，分别为0.15625, 0.3125, 0.625, 1.25和2.5mg/kg 腹腔注射。ACNP-MMC 5个剂量组，分别为ACNP-MMC（以MMC剂量计）0.625, 1.25, 2.5, 5.0和10.0mg/kg，于孕第6～15天定时连续腹腔注射（临床应用途径）。实验期间分别于妊娠0（出现阴栓日），3,7,10,13,16日称孕鼠体重。妊娠第18天时解剖孕鼠，记录各鼠着床、活胎、死胎、吸收胎数并观察有无外观畸形，并用电子天平称孕鼠、胎鼠体重和胎盘重，用Manostat游标尺测量胎仔身长和尾长。将1/2胎鼠固定于liouin氏液中做内脏畸形观察，另一半固定于95%酒精中，然后经透明、茜素红染色做骨骼畸形检查，记录各鼠性别。
1.3 统计学处理 各项检查数据用SPSS软件进行t检验和χ2检验。
2 结果
2.1死亡率 游离MMC在1.25mg/kg有2/10小鼠死亡，在2.5mg/kg有5/10死亡，与MMC的LD50一致。ACNP-MMC各组未有小鼠死亡。
2.2 小鼠骨髓PCE微核试验试验结果 如表1。试验数据采用t检验进行统计学处理。各组统计结果表明，阴性和阳性对照组间微核率差异有显著性，游离MMC各给药组和阴性对照组间微核率差异均有显著性，ACNP吸附MMC和阴性对照组间微核率差异无显著性，而与游离MMC对照组之间却有明显差异，表明ACNP明显地减弱了MMC增加小鼠骨髓PCE微核阳性率的作用。表1 ACNP-MMC对小鼠骨髓注：mean SD, 动物数（n） = 10, PCE数 = 10000，***P<0.001, 与Normal saline组比较；+++P<0.001与等剂量游离MMC比较；###P<0.001与游离MMC 0.15625mg/kg 组比较
2.3 CHL染色体畸变试验 无S9时阴性对照组染色体畸变率在正常范围，药物组在5～0.625μg/ ml剂量间染色体畸变率也在正常范围（1.5%～4.5%）;游离MMC对照组染色体畸变率显著增加、表现为强阳性（+++），具有高度显著性。有S9时，阴性对照S9混合液组染色体畸变率也在正常范围内，ACNP-MMC组在0.625～20.0μg/ml剂量间染色体畸变率也在正常范围（2%～4.5%）, 10～ 20μg/ml剂量组染色体畸变率为可疑阳性（见表2）。 表2 ACNP-MMC对小鼠骨髓PCE微核率的影响注：细胞数（n） =200, *P<0.05，***P<0.001, 与Normal saline组比较；#P<0.05与游离MMC 0.15625 mg/kg 组比较
2.4 致畸试验
2.4.1 对孕鼠一般状况的影响 游离MMC在所用剂量下，使孕鼠体重增长减缓，同时可见活动减少、食欲下降及毛发蓬松等异常现象；在2.5mg/kg组有3只小鼠死亡。ACNP-MMC各剂量组小鼠与生理盐水组相比未见有一般状况的明显改变，表明ACNP吸附MMC后可明显减轻MMC的一般毒性作用。
2.4.2 对胚胎发育的影响 各试验组小鼠受孕数、着床数、平均活胎数、吸收胎率等与阴性对照组比较，差异无显著性。也未见外观畸形。阳性对照CP组和游离MMC对照组有明显的短肢、短尾、眼球突出和脑膨出等多种外观畸形。在0.15625～0.3125 mg/kg, MMC即已有减少活胎数，增加胎吸收和死胎数的倾向，但差异无显著性；在0.625～2.5 mg/kg, 减少活胎数，增加胎吸收和死胎率与对照组相比差异有显著性。ACNP-MMC给药组的产仔率高于对照组，受孕数、着床数、活胎数、吸收胎率与对照组比较，无明显差异（见表3），而与等剂量游离MMC组相比差异有显著性。即使在远大于游离MMC的剂量范围内，即5～20 mg/kg, ACNP-MMC对活胎数的减少作用和对胎吸收和死胎数的增加作用也明显低于游离MMC 0.625 mg/kg 组，表明ACNP可以明显减弱MMC对胚胎发育的毒性作用，其减少的量值至少为32倍。表3 ACNP-MMC对小鼠受孕及胚胎发育的影响注：小鼠数（n） =15, *P< 0.05，**P<0.01, 与Normal saline组比较；+P<0.05与等剂量游离MMC 组比较；#P< 0.05与游离MMC 1.25 mg/kg 组比较
2.4.3 对胎鼠生长发育的影响 如表4, 游离MMC在0.15625～2.5mg/kg 剂量组,胎鼠体重、身长、尾长及胎盘重均低于阴性对照组，但ACNP-MMC自0.625～20mg/kg 各剂量组与生理盐水对照组相比均无明显的差异，表明ACNP可以明显减弱MMC对胎鼠生长发育的影响。表4 ACNP-MMC对胎鼠生长发育的影响注：小鼠数（n） =15, *P<0.05，**P< 0.01,***P<0.001与Normal saline组比较；+P<0.05，+P <0.01与等剂量游离MMC 组比较
2.4.4 对胎鼠内脏畸形的影响 如表5，用放大镜按顺序检查各脏器大小、形状及位置，发现阴性对照和ACNP-MMC 1.25和2.5 mg/kg 剂量组分别有1例和2例腭裂，但发生率并无剂量依赖关系，属自然发生，与用药无关。游离MMC在0.625～2.5mg/kg剂量下，可明显增加胎鼠畸形率。ACNP - MMC 各剂量组均无增加胎鼠畸形率作用。与等剂量下的游离MMC相比，ACNP明显降低游离MMC的致畸作用。表5 ACNP-MMC对胎鼠畸形发生率的影响注：小鼠数（n） =15, *P< 0.05，**P< 0.01, ***P<0.001与Normal saline组比较；+P<0.05，+ P<0.01与等剂量游离MMC 组比较
2.4.5 对胎鼠骨髓系统的影响 用放大镜检查各试验组的骨骼透明标本，与阴性组比较未见明显异常。游离MMC 2.5 mg/kg 剂量组有3只胎鼠出现枕骨和胸骨骨化迟缓。环磷酸胺组却出现枕、胸、肋骨缺失、发育不全、裂开等明显异常。ACNP - MMC各剂量组均未发现胎鼠骨髓系统有明显的病理改变。
3 讨论
环境致癌原与诱变剂的检测不能仅仅依靠单一试验。鉴于没有一种检测系统可评价所有的致癌原和诱变剂［7］，因此本文采用药物致突变及生殖毒性检测的试验，即微核试验、染色体畸变试验［8］及致畸试验［9］对ACNP - MMC的生殖和遗传安全性进行初步探讨。结果显示ACNP吸附MMC后，可以明显减弱MMC的遗传和生殖毒性。
纳米粒子随粒径不同，可选择性地分布于某一组织或器官，称之为组织靶向性。由于这种组织靶向性，可以将其所吸附的药物也在相应的靶组织内富集。这使药物在体内的分布发生改变。药物在某一组织或器官内的富集，有可能加强药物在该组织或器官中的作用。MMC为染色体断裂剂，具有明显的遗传和生殖毒性。ACNP吸附MMC后，会不会增强MMC对遗传和生殖系统的毒性，是ACNP作为抗癌药物靶向载体应用中的一个十分重要的问题，同时也是新兴的纳米技术在医药领域中应用的一个重要问题。本文对这一问题进行了初步探索。结果是令人兴奋的，即ACNP不仅没有增强MMC的遗传和生殖毒性，而且可以使之大减弱。从表1～5可以明显看出，ACNP吸附MMC后腹腔注射，在剂量为20 mg/kg时，其遗传和生殖毒性也并不比游离MMC 0.625mg/kg时的毒性强。可以认为，ACNP吸附MMC腹腔注射，可以使MMC的遗传和生殖毒性减弱30倍以上。
ACNP具有良好的淋巴靶向性，腹腔注射后，主要分布于腹腔淋巴引流系统的淋巴组织。因此ACNP吸附MMC后，使MMC也主要分布于腹腔的淋巴引流系统，因而进入血液中的MMC大大减少，分布到生殖系统的MMC也随之减少，因此，ACNP吸附MMC腹腔注射，可以大减弱MMC的遗传和生殖毒性。
【参考文献】
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作者单位：1 467000 河南平顶山，平顶山市妇幼保健科研所2 100850 北京，军事医学科学院毒物药物研究所