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【摘要】 目的 从药用植物楮头红中分离纯化多糖成分并验证其生物活性。方法 用热水提取，乙醇沉淀提取粗多糖，再经Sevag法去除蛋白，透析去除小分子物质，冷冻干燥得楮头红多糖粗品；采用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-200凝胶柱层析进行分离纯化；用TBA法考察多糖的抗脂质过氧化作用；采用CCl4急性肝损伤模型，测定其血清中AST变化。结论 获得一个楮头红多糖组分。TBA法表明该组分对小鼠自发性脂质过氧化具有显著的抑制作用；在保肝试验中，给药组能明显抑制AST的升高，对肝损伤有一定的保护作用。
【关键词】 楮头红多糖；分离；纯化；生物活性
*基金项目：福建省自然科学基金（编号：B0510012）
Isolation,purification of S. nepalensis Wall polysaccharide and its bioactive validation
HE Hai-bin,ZHU Qing-yin,CHEN Qiang,et al.Department of Chemistry and Biology,Fujian Agriculture and Forestry,Fuzhou 350002,China
【Abstract】 Objective To isolate,purify the polysaccharides from Sarcopyramis nepalensis Wall and validate its bioactivity.Methods The crude product of S. nepalensis Wall polysaccharide was prepared with hot water extraction,ethanol precipitation,dialyzation,and lyophilization.The crude polysaccharide was separated by DEAE-cellulose chromatography and purified by Sephadex G-200 chromatography.The inhibit effect of the polysaccharide on lipid peroxidation of mice liver was conducted by TBA method.The model of liver-injury induced by carbon tetrachloride（CCl4)was used to validate the variety of the realated AST.Results Onefold ingredient polysaccharide was obtained after isolated and purified.Conclusion The ingredient can remarkably inhibit lipid peroxidation of rat liver and significantly reduce activity of AST.
【Key words】 S.nepalensis Wall polysaccharide;isolation;purification;bioactivity
楮头红（S.nepalensis Wall），别名风柜斗草。《中药大辞典》记载：其性凉、味酸、无毒；功用：清肺热，去肝炎；《实用中草药》记载：其性平、味甘。功用：清热解毒、凉血利水。主治急性肝炎，肺热咳嗽。据有关临床使用报道：楮头红对急性肝炎（甲肝、乙肝急性期）疗效最佳，对慢性肝炎及乙肝病毒携带者有效［1，2］。楮头红已在福建省民间广为使用，是一种极有价值的天然中草药资源。前期研究表明，楮头红中含有游离苷类物质、黄酮类物质、酚类、鞣质类等物质，含量较高的多糖和较丰富的人体所必需的营养元素［3］。为了进一步研究楮头红的生理药理作用，在前期研究基础上，我们对楮头红多糖进行了分离纯化，对获得组分的生物活性进行了初步验证。
1 材料与方法
1.1 仪器 电子天平（梅特勒-托利），恒温水浴锅（上海贝凯），低速大容量离心机（上海安亭），1600分光光度计（北京瑞利），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣），MC99-3自动液相色谱分离层析仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦）。
1.2 材料与试剂 楮头红（购自三明和漳州的天然药用植物，经福建中医研究院鉴定）；DEAE-52填料（whatman）、sephadexG-200填料（Pharmacia）、透析袋（3500）、联苯双酯滴丸（北京协和药厂）；石油醚（沸程60～90℃）、95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、98%浓硫酸、氯仿、氯化钠、氢氧化钠、正丁醇等，均为分析纯。
1.3 楮头红粗多糖的提取
1.3.1 楮头红多糖的提取［4，5］ 楮头红全草用蒸馏水洗涤去土，40℃低温干燥、粉碎。称取草药250g,用石油醚80℃回流脱脂2次，之后用95%乙醇除小分子单糖，滤渣挥去酒精，晾干后于90℃回流提取3次，每次2h，合并滤液，离心去除不溶物。滤液加0.1%的活性炭60℃保温30min，不断搅拌脱色，过滤，取上清液放入-40℃冰箱过夜，第二天取出自然融化后离心（5000r/min）去除不溶物。上清液浓缩适当的体积后缓缓加入5倍量的95%乙醇沉淀，过滤，沉淀依次用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复3次。
1.3.2 除蛋白［9］ 用Sevag法脱蛋白，氯仿正丁醇4：1，多糖溶液和混合液的体积比为3：1，混合搅拌20～30min，充分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀。
1.3.3 透析干燥 多糖复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液（蒸馏水）体积比为1：20，4h换一次水。将透析液进行冷冻干燥后即得粗多糖。
1.4 楮头红粗多糖的纯化分离［6～13］
1.4.1 DEAE-52柱层析 DEAE-52填料依次用0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、0.5mol/L NaOH处理（每次30min），再以蒸馏水洗至中性后装柱（柱尺寸为40cm×2.5cm）。装柱后用蒸馏水平衡48h。将粗多糖溶于少量重蒸水（5～8mg/ml），过柱，上样量为交换容量的10%～20%。用水、0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl梯度洗脱，用自动部分收集器每15min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测各主峰组分，将各主峰位分别收集合并，蒸馏水透析2天，冷冻干燥得楮头红多糖。
1.4.2 Sephadex G-200 柱层析 将Sephadex G-200填料加适量蒸馏水浸泡12h，100℃煮沸4h，脱气后装柱，用0.05mol/L NaCl平衡48h。将1.4.1中收集的各主峰组分进一步纯化，用0.05mol/L NaCI洗脱，自动部分收集器每30min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测。收集各主峰组分，冷冻干燥。
1.4.3 HPLC 纯度验证 将多糖溶解成合适浓度，过0.45μm的滤膜后进样，进样体积20μl，流速1.0ml/min，示差检测器检测（检测器温度35℃），柱温箱温度35℃。
1.5 多糖的生物活性验证
1.5.1 小鼠肝自发性脂质过氧化实验［14］ 小白鼠禁食18h，引颈法处死，迅速取出肝脏，用4℃下预冷的0.01mol/L PBS（pH为7.4）洗去表面残血，滤纸吸干。用玻璃匀浆器将肝脏制成10%的肝匀浆。取该匀浆1ml，加不同浓度的多糖溶液600ul，对照管不加样品，用PBS作空白，于37℃温育2h，加入20%三氯乙酸1ml终止反应，3500r/min离心10min，取上清液2ml加入0.67%硫代巴比妥酸（TBA）1ml，90℃水浴15min，取出后流水冷却。于532nm处测A值，以不加肝匀浆和样液为比色空白样（A0），以加肝匀浆不加样品为对照样（Ai），按下式计算脂质过氧化物（LPO）的清除率：LPO的清除率（%）=（A0-Ai）/A0×100
1.5.2 多糖保肝活性试验［15］ 取50只健康小鼠（昆明种，体重18～22g，由福建医科大学实验动物中心提供），雌雄各半，随机分为5组，每组10只。1-2组为给药高低剂量组（给药按临床成人50g/50kg量折算为小鼠给药量，600mg/kg，800mg/kg体重），3组为联苯双酯阳性对照组（200mg/kg，每丸1.5mg），4组为CCl4模型组，5组为空白组。正式实验前，所有动物禁食不禁水12h。从第二天开始，每天1次，连续灌药15天，空白组和模型组灌0.6ml的生理盐水，给药组灌同等体积的多糖，在最后一次灌药后1h，除空白组外，其余四组皮下注射0.5%的四氯化碳-花生油溶液（0.1ml/10g），禁食12h后立即摘除眼球采血。3500r/min离心，取上清液。测定血清AST活力。
2 结果与分析
2.1 粗多糖DE-52柱层析结果 由图1可以看出，经DEAE-52柱层析，可以得到两个相对明显的组分，组分Ⅰ为水洗脱组分，组分Ⅱ为NaCl梯度洗脱的组分，且达到了较好分离效果。
图1 多糖梯度洗脱曲线（DEAE-52柱）2.2 Sephadex G-200柱纯化结果 由图2可以看出，组分Ⅱ经两次过柱后，得到进一步纯化，可以看出其为单一组分，但其纯度还需进一步验证。
图2 组分Ⅱ在Sephadex G-200柱上的洗脱曲线
2.3 组分Ⅱ过柱纯化后纯度验证 从图3可以看出，经DEAE-52纤维素柱和sephadex G-200凝胶柱纯化后的多糖组分Ⅱ，在HPLC图谱上只有一个峰，与前面凝胶色谱结果吻合，说明此组分相对均一。
图3 组分Ⅱ的HPLC图谱2.4 楮头红多糖生物活性实验 小鼠肝自发性脂质过氧化实验结果表明（见图4），随着多糖浓度的增加其抗脂质过氧化能力逐渐增强，且在一定浓度范围内呈现剂量效应关系，当多糖浓度达到1.4mg/ml时抑制率达到50%，显示了较强的抗氧化能力，这对于细胞免受过氧化损伤，维持细胞正常生理功能具有积极意义。
图4 楮头红多糖的抗脂质过氧化作用楮头红多糖保肝实验结果表明（见表1），楮头红多糖能够显著降低CCl4诱导的肝损伤小鼠中升高的AST活性，其作用可能与抑制膜脂质的过氧化，维持肝细胞膜的完整性，从而产生保肝作用有关。表1 楮头红粗多糖对CCl4肝损伤小鼠AST影响注：△与正常对照组比较；*与四氯化碳组比较。
3 讨论
采用水提醇沉法从药用植物楮头红中提取到水溶性粗多糖，经脱色、除蛋白、透析后，再经柱层析纯化后，得到一个高纯度的多糖组分。该组分对小鼠肝自发性脂质过氧化和肝损伤具有一定的保护作用。其他方面的生物活性，如增强免疫活性、抗病毒等作用，尚需要进一步研究确认。本研究为今后的楮头红多糖结构和生物活性研究奠定了基础，为开发楮头红多糖类药物提供了理论依据。
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作者单位：1 350002 福建福州,福建农林大学生命科学学院化学生物系（△通讯作者） 2 350002 福建福州，福建农林大学动物科技研究所