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【摘要】 目的比较药物A、药物S和药物B三种单方制剂和含三种药的复方制剂参丹脑梗通在抗急性脑缺血和缺血再灌注损伤上的差异。方法建立小鼠急性脑缺血和缺血再灌注模型（CIR），观察药物A注射液（8.0mg/kg）、药物S注射液（33.0mg/kg）、药物B注射液（13.3mg/kg）和参丹脑梗通注射液（54.3mg/kg）对小鼠存活时间、脑含水量、脑组织中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的影响。结果与单方制剂相比，参丹脑梗通注射液延长小鼠存活时间的能力明显增强（P<0.05）；参丹脑梗通注射液抑制MDA含量增加和抑制SOD、LDH、GSH-Px活性降低的效果更明显（P<0.05）。然而，在抑制CIR损伤诱导的脑含水量增加时，单药组方与参丹脑梗通之间差异无显著性。结论复方制剂参丹脑梗通（54.3mg/kg）对小鼠急性脑缺血和缺血再灌注损伤均具有保护作用，其抗脑缺血缺氧、减轻自由基损伤、减轻炎症反应的综合作用均优于药物A、药物S和药物B三种单药组方。
【关键词】 急性脑缺血模型；缺血再灌注模型；复方注射液
【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1609-6614（2011）01-0010-04
脑缺血又称缺血性中风、脑梗死，是一类由于脑血流供应障碍引起缺血、缺氧、导致脑局限性坏死的疾病［1］。目前，缺血性脑血管病临床用药急缺，中药注射剂仅有灯盏花素注射液、黄芪注射液、冠心宁注射液等少数几个品种［2］，大多为活血化瘀类或益气类的单方制剂组方，临床上还没有一个对中风急性期、恢复期都有效的药物。已有的报道表明，药物B只用于急性期的治疗，而药物S只用于恢复期治疗，药物A对脑缺血缺氧再灌注损伤具有保护作用。因此，本研究用药物A、药物S和药物B配伍，制成复方注射液，命名为参丹脑梗通。选择ICR小鼠，建立小鼠急性脑缺血和缺血再灌注模型（CIR），观察复方注射液参丹脑梗通对小鼠急性脑缺血和缺血再灌注损伤的保护作用是否优于药物A、药物S和药物B三种单药组方。
1材料
1.1动物小鼠：ICR品系，SPF（清洁级），由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
1.2药物 药物A注射液(A)，8.0mg/ml，生产批号：NGT-1001-A。药物S注射液(S)， 16.7mg/ml，生产批号：NGT-1001-B 。药物B注射液(B)，13.3mg/ml，生产批号：NGT-1001-C。参丹脑梗通注射液(ASB)，54.3mg/kg，生产批号：NGT-1001-G。4种注射液均由北京因科瑞斯医药科技有限公司提供。临用时均用氯化钠注射液（0.9%）配成所需浓度。
1.3仪器与试剂
1.3.1仪器DY89-I型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研究所生产；DL-4000B低温冷冻离心机，上海昨非实验室设备有限公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；恒温电热干燥箱，中国重庆试验设备厂。
1.3.2试剂丙二醛（MDA）试剂盒，批号：20100505；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，批号：20100505；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，批号：20100326；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，批号：20100326；考马斯亮蓝蛋白含量测定试剂盒，批号：20100505；上述试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
2统计学方法
以SPSS统计软件，进行统计学处理。实验结果用平均值±标准差(±s )表示，组间差异用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
3实验方法
3.1复方注射液对全脑急性脑缺血小鼠存活时间的影响取上述健康小鼠，雌雄各半，随机分为5组（分组、给药剂量见表1）。尾静脉给药（0.2ml/10g bw）后，小鼠腹腔注射4%水合氯醛 (0.15ml/10gbw)麻醉，随即完全结扎左侧颈总动脉合并迷走神经，右侧颈总动脉下放置一鱼线，结扎后抽出鱼线，形成右侧颈总动脉的不完全结扎，缝合皮肤，记录术后各实验组小鼠存活时间（每分钟呼吸少于或等于5次为死亡）。模型组（M）小鼠注射相同体积的氯化钠注射液。
3.2复方注射液对全脑缺血再灌注（CIR）小鼠脑含水量和生化指标的影响给药剂量、给药方式和麻醉同上。小鼠按体重随机分为6组（分组见表2），CIR模型参照文献［3］并加以改进，动脉夹夹闭双侧颈总动脉合并迷走神经10min，松开动脉夹使血液灌流10min，重复1次，最后一次复灌30min，形成小鼠全脑缺血再灌注模型（CIR）。伪手术组仅分离双侧颈总动脉合并迷走神经，但不夹闭不灌注。于末次复灌结束后，处死动物，各组小鼠在冰盘上迅速开颅取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，称脑湿重，将脑置于105℃烘箱中烘干燥24h至恒重，计算脑含水率：脑含水量（%）＝（脑湿重－脑干重）/脑湿重×100%。在脑组织生化指标的检测中，取脑称重量后，加10倍体积的氯化钠注射液，在冰上用电动匀浆机研磨成脑匀浆，3500rpm离心10min，取上清液于-80℃冻存，待测上清液中蛋白质含量、MDA含量、SOD活性、LDH和GSH-Px活性，操作步骤严格按试剂盒说明进行。
4实验结果
4.1复方注射液对小鼠急性脑缺血损伤的作用如表1和图1所示，模型组和药物S注射液组小鼠在2h内大部分死亡，药物A注射液组75%的小鼠在2h内死亡，17%在6h内死亡，8%在12h内死亡。药物B注射液组66%的小鼠在2h内死亡，25%在6h内死亡，9%在12h内死亡。参丹脑梗通注射液组16%的小鼠在2h内死亡，而42%在6h和12h内死亡。与模型组相比，参丹脑梗通注射液组小鼠的存活时间明显延长（P<0.05）。与药物A、药物S、药物B注射液组相比，参丹脑梗通注射液延长小鼠存活时间的能力明显增强（P<0.05）。表1受试物对急性脑缺血小鼠死亡数和存活
时间的影响（±s，n=12）
组别剂量
（mg/kg bw）
动物死亡数（只）
2h内 6h内 12h以上 存活时间（min）
A8.0 9 2 1 99.0±69.3
S 33.0 10 2 0 60.7±32.2
B 13.3 8 3 1 112.1±53.7
ASB 54.3 2 5 5 311.3±93.3* # &Δ
M 同体积溶媒 11 1 0 76.7±42.8
注：与M组比较 *P<0.05，与A组比较 #P<0.05，与S组比较&P<0.05，与B组比较ΔP<0.05
图1受试物对急性全脑缺血小鼠存活时间的影响
4.2复方注射液对小鼠脑缺血再灌注（CIR）损伤的作用如表2所示，脑缺血再灌注模型组（CIR）小鼠脑含水量明显升高，与CIR模型组相比，各实验组均能明显抑制CIR损伤诱导的脑含水量增加（P<0.05）。
表2受试物对CIR小鼠脑含水量的影响(±s,n=10)
组别 剂量（mg/kg bw） 脑含水量 (%)
A 8.0 79.51±0.22*
S 33.0 80.13±0.13*
B 13.3 79.27±0.35*
ASB 54.3 79.34±0.20*
J 同体积溶媒 79.04±0.24*
M 同体积溶媒 80.96±0.24
注：与M组比较*P<0.05
如表3和图2所示，与伪手术组相比，CIR模型组小鼠脑组织MDA含量明显增加，脑组织SOD、LDH和GSH-Px的活性明显降低（P<0.05）。与CIR模型组相比，药物A、药物S、药物B、参丹脑梗通注射液均能显著抑制MDA含量的增加，同时显著抑制SOD、GSH-Px活性的降低（P<0.05）。与药物A、药物S、药物B注射液相比，参丹脑梗通注射液抑制MDA含量增加的效果更明显（P<0.05），抑制SOD和GSH-Px活性降低的效果也更明显（P<0.05）。与CIR模型组相比，药物A、药物B、参丹脑梗通注射液均能显著抑制LDH活性的降低（P<0.05）。与药物A、药物S注射液相比，参丹脑梗通注射液抑制LDH活性降低的效果更明显（P<0.05）。
表3受试物对CIR小鼠脑组织MDA含量、SOD活性、LDH和GSH-Px活性的影响（±s，n=18）
组别 剂量（mg/kg bw） MDA(nmol/mgprot) SOD(U/mgprot) LDH(KU/gprot) GSH-Px(activity)
A 8.0 2.05±0.64* 199.12±15.31* 15.11±1.66* 124.72±23.34*
S 33.0 2.48±1.00* 215.63±13.42* 7.17±2.46 139.87±16.95*
B 13.3 1.91±0.56* 236.35±19.60* 18.92±1.79* 155.06±27.38*
ASB 54.3 1.01±0.26*# & Δ274.96±8.25*# & Δ21.06±1.09*# &232.11±15.58*# & Δ
J 同体积溶媒 1.28±0.41* 255.80±23.26* 20.42±2.32* 189.99±18.14*
M 同体积溶媒 3.82±1.61 162.90±14.55 6.36±0.82 72.83±12.09
注：与M组比较*P<0.05，与A组比较#P<0.05，与S组比较&P<0.05，与B组比较ΔP<0.05
注：与M组比较 *P<0.05，与A组比较#P<0.05，与S组比较&P<0.05，与B组比较ΔP<0.05
图2受试物对CIR小鼠脑组织MDA(A)、SOD(B)、LDH(C)和GSH-Px(D)的影响5小结目前缺血性脑血管病发病率逐年上升，也是致成人长期严重残疾的最常见疾病［4］。然而，缺血性脑血管病临床用药急缺，并且多为活血化瘀类的单方制剂。药物A的有效部位为皂苷类物质，药理学研究表明其具有抗脑缺血作用。本实验在药物S和药物B二药活血化瘀的基础上加入药物A，运用中医理论进行组方配伍，组成益气活血方［5］，充分发挥了三种药在中风治疗上的不同作用机制。动物实验表明，在抗急性脑缺血和再灌注损伤作用上，含三种药的复方制剂参丹脑梗通优于单组方制剂主要表现在以下几个方面：药物A（8.0mg/kg）、药物S（33.0mg/kg）和药物B（13.3mg/kg）不能明显延长小鼠存活时间，而参丹脑梗通注射液（54.3mg/kg）能明显延长小鼠存活时间（P<0.05）。单方制剂相比，参丹脑梗通注射液更有利于延长小鼠的存活时间（P<0.05）。另外，参丹脑梗通注射液抑制MDA含量增加和抑制SOD、LDH、GSH-Px活性降低的效果优于三种单方制剂（P<0.05）。含三种药的复方制剂参丹脑梗通对小鼠急性脑缺血缺氧和缺血再灌注损伤均具有较好疗效，而单方制剂仅对脑缺血再灌注损伤有疗效，其抗脑缺血损伤的作用比较单一。综上所述，复方注射液参丹脑梗通（54.3mg/kg）对小鼠急性脑缺血和缺血再灌注损伤均具有保护作用，其抗脑缺血缺氧、减轻自由基损伤、减轻炎症反应的综合作用均优于药物A、药物S和药物B三种单方制剂。
(致谢：感谢山西长治医学院药学专业本科生耿伟健、白建云参与此次研究！)
【参考文献】
1韩敏, 刘艳凯. 脑缺血再灌注损伤的研究进展. 河北北方学院学报(医学版),2006, 23 (5):75.
2闫芳，李传云. 中药注射剂治疗脑梗死研究进展. 山东医学高等专科学校学报, 2006, 28 (6):456.
3臬聪, 彭飞城, 钱之玉. 西红花酸对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用. 中国临床药理学与治疗学, 2009, 14 (4):421.
4Zweifler RM. Management of acute stroke. South Med J, 2003,96:380.
5王业梅, 王键. 益气活血法在中风病中的应用研究进展. 中医药临床杂志, 2005, 17 (1):89.