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【摘要】 目的 检测神经细胞黏附分子(NCAM)在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达，探讨NCAM分布情况与其在视神经再生中的作用。方法 选择64只健康成年雄性SD大鼠，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型32只为实验组，自体视神经—视神经吻合模型32只作对照组。于吻合术后15天、30天、45天、60天处死动物并取出吻合段神经。利用免疫组织化学方法(SP法)和计算机图像分析技术，测定NCAM在不同吻合模型中的表达。结果 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型表达水平高于视神经—视神经吻合模型。吻合术后早期表达水平明显高于末期。结论 坐骨神经移植有助于增加NCAM表达，促进视神经再生。
【关键词】 神经细胞黏附分子；视神经再生；坐骨神经；免疫组织化学
Expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats
ZHU Yi-hua,ZHU Jie,TANG Bao-feng,et al.
Ophthalmology Department,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats.Methods 64 SD rats were randomly divided into two groups.The right optic nerve of all rats were transected.In the experiment group,an autologuous sciatic nerve of 15mm segment in the right was anastomosed to the distal optic nerve stump.In the control group,the cut ends of optic nerve were reapproximated by sutures.Animals were allowed to survive for 15,30,45 and 60days.The anastomosed nerves were taken from them and determined the expression of NCAM by immunohistochemistry.The immunohistochemistry stainings were analyzed by automatic image analysis technology.Results The expression of NCAM in the experiment group were significantly higher than in the control group.Conclusion NCAM could play an important role in the regeneration of the optic nerve.A sciatic nerve graft onto the transected optic nerve help to induce the regeneration in adult rats.
【Key words】 NCAM；optic nerve regeneration; sciatic nerve;immunohistochemistry
近年神经生物学研究显示：视神经具有再生潜能，只是局部的微环境影响它的再生。坐骨神经的成功再生有赖于一个适宜的微环境，因而将坐骨神经移植到受损的视神经，改变视神经微环境，有可能促进视神经再生。神经细胞黏附分子(NCAM)在神经再生中的重要作用越来越受到关注。本课题就NCAM在成年大鼠自体视神经—坐骨神经吻合模型和视神经—视神经吻合模型术后不同时期的表达进行研究，探讨NCAM在视神经修复和再生中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague-Dauley大鼠150～200g，共64只(由福建医科大学实验动物中心提供)，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型组32只作实验组，自体视神经—视神经吻合模型组32只作对照组。按吻合术后15天、30天、45天、60天分别将各组随机分入4个时间点。每个时间点实验组及对照组各8只。
1.2 动物模型的建立
1.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 大鼠用氯胺酮10mg/kg腹腔麻醉，眼科手术显微镜下，经右侧眶上缘切口钝性分离至球后、暴露视神经，距眼球壁后4mm切断视神经，将取自体右下肢长约15mm的坐骨神经近中端与视神经远中残端行端-端吻合，并在吻合处以硅胶套管，坐骨神经另一端固定于头皮下。最后缝合切口。
1.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 动物依上法暴露右眼视神经，距眼球壁4mm切断视神经，将两断端行端-端吻合。距此吻合处4mm切断视神经，将此断端固定于头皮下，最后缝合切口。
1.3 标本的取材、固定、制作 于吻合术后15天、30天、45天、60天各处死实验组及对照组大鼠各8只。取吻合段神经标本长约5mm。经10%中性福尔马林固定，常规脱蜡，石蜡包埋，作4μm厚石蜡切片。
1.4 HE染色 石蜡切片烤片过夜，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸酒精分色，伊红染色，常规脱水后中性树胶封固。
1.5 免疫组织化学SP法 石蜡切片，使用SP-超敏试剂盒(福建迈新公司)染色。第一抗体NCAM Ab-1(1∶100)为美国NEOMARKERS公司产品。AEC显色，苏木精对比染色，水性封固。切片在相同一条件下进行。以PBS代替一抗作阴性对照；以大脑阳性片作阳性对照。
1.6 图像分析 光镜下，依着色强度分为强阳性、阳性、弱阳性、极弱阳性和阴性。标本经Video Pro32彩色图像分析系统(澳大利亚Leading Edge Pty Ltd)处理：每组取8张不同样本切片，置于物镜(×40)下，每张切片取3个视野，通过彩色图像分析系统，分别测量平均光密度值(OD)。
1.7 统计学方法 对所得的数据进行统计处理，用均数±标准差（±s）表示。比较NCAM在大鼠坐骨神经及视神经的表达平均光密度值，采用独立样本比较t检验，不同发育时间OD值比较采用方差分析、Post Hoc t检验，以P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
2.1.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 在取材的过程中可见视神经与坐骨神经断端连接良好，吻合处光滑，未见神经瘤样膨大，并且有完整且连续的神经外膜，两条神经已成为一体、视神经端明显增粗、管径与坐骨端大小基本相同。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.1.2 自体视神经—视神经吻合模型 吻合术后15天可观察到，视神经两断端外膜已连接，吻合处未见神经瘤。视神经有萎缩，管径变细。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.2 HE染色结果
2.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 15天组可见神经轴突变性较明显，大部分崩解，呈网状分层、形成较大的空泡。淋巴细胞浸润，30天组可见神经变性仍明显，空泡可见，少许视神经纤维增生，淋巴细胞浸润明显。45天组及60天组神经变性较轻，空泡明显减少，视神经纤维大量增生。
2.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 15天组视神经溃变，纤维变细小，部分断裂、不连续。较多淋巴细胞浸润。30天及45天视神经溃变明显，纤维断裂，未见明显的纤维增生。60天组视神经溃变较重，大部分纤维断裂、崩解成空泡或网状，未见有明显的纤维增生。
2.3 NCAM免疫组织化学染色结果
2.3.1 在视神经—坐骨神经吻合模型表达 在吻合术后4个不同时间组，均可见分布。表现为红色至浅红色，不规则的线状。随着术后时间增加，反应强度逐渐减弱。其中术后15天组表达相对较强，着色最深，表现为阳性、红色(见图1)。相对15天组，术后60天组反应较弱、着色较浅，表现为弱阳性、浅红色(见图2)。
2.3.2 视神经—视神经吻合模型表达 呈弱阳性—极弱阳性，表现为淡红色稀疏地散在于神经胶质细胞附近。术后15天组可见少量表达(见图3)，其余30天组、45天组、60天组表达不明显。
2.4 计算机图像分析 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型组(SON)和视神经—视神经吻合模型组(OON)表达的OD值，见表1。SON组表达水平明显高于OON组。
表1 NCAM在SON组和OON组表达的OD值 略
3 讨论
NCAM是细胞黏附分子的一员，属免疫球蛋白超家族，分布在神经细胞和星形胶质细胞表面。不同的神经细胞有不同空间和时间的NCAM基因表达，NCAM mRNA又经历不同的剪接，因而在不同的发育时间可表现出不同的细胞黏着性。NCAM突出的生物学功能是：和邻近细胞的其他NCAM分子结合，介导神经元之间同型识别和黏附，在神经元发育中NCAM参与黏附与轴突生长及延伸，并可能促进突触的可塑性，因此认为NCAM在神经系统发育和神经再生中发挥着重要作用［1］。
体外神经元培养的研究发现：NCAM能刺激神经元轴突延伸，小脑神经元在转染了NCAM cDNA的3T3细胞后，生长得更快，轴突分支也更多［2］。NCAM促进轴突生长的原因可能是它们通过为神经元突起生长提供更具黏附性的基质而起的机械性作用，或者它们的相互作用可能启动了能刺激轴突延伸的细胞内信号，有研究表明，NCAM激活神经元第二信号级联反应而激发神经生长［3］。NCAM介导的细胞间的相互作用至少在再生早期作为再生过程的一个重要反应。
雪旺细胞(SC)是重要的神经胶质细胞，SC及其分泌的分子构成的微环境，使坐骨神经再生变得容易。许多体外和体内实验表明，SC不仅能支持周围神经再生，还能促进脊髓、视神经等中枢神经突起生长［4］。SC不仅是视网膜神经节细胞(RGCs)再生的良好基质，还和许多分子有着密切的联系，这是RGCs成功再生不可或缺的。有学者研究显示SC利用NCAM局部的紧密联系来建立与延长轴突的稳定性接触［4］。RGCs再生不单是一个轴突在移植的坐骨神经中生长，它建立在轴突与SC之间直接的动态联系，伴随着胶质细胞之间的变化和反应，SC在再生中产生多种功能物质，如神经生长因子，这些分子共同诱导RGCs再生［4］。存活的SC能持续表达NCAM分子［5］。
本研究发现在视神经—坐骨神经吻合模型中，NCAM在各时期吻合神经段均有较多表达，然而在自体视神经断端吻合中表达较少、到后期基本无表达。提示视神经损伤时并不能分泌较多NCAM分子促进自身修复。在视神经—坐骨神经吻合模型中，NCAM表达水平明显增加，这进一步证实NCAM在大鼠视神经损伤及修复中发挥重要作用。随着吻合术后时间增加，坐骨神经—视神经吻合模型中NCAM表达下降，这与离体的坐骨神经溃变，SC减少，分泌NCAM下降可能有关系。
本研究成功建立大鼠视神经—坐骨神经吻合模型，组织学研究观察到较多的视神经纤维增生。我们曾用透射电镜观察了视神经—坐骨神经吻合段的超微结构，发现了再生的视神经纤维，进一步证实坐骨神经移植物的确有助于视神经再生［6］。而自体视神经两断端吻合术后未见有再生的视神经纤维。移植大鼠坐骨神经至受损的视神经局部，能改变视神经的微环境，增加了NCAM的表达，显著促进了视神经再生。
（本文图片略）
【参考文献】
1 Fercakova A.Kosice,Slovakia.Cell adhesion molecules in the neural development and plasticity.Bratisl Lek Listy,2001,102(12):552-555.
2 蔡文琴.发育神经生物学.上海：上海科学出版社，1999，60.
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4 Dezawa M,Adachi-Usami E.Role of Schwann cells in retinal ganglion cell axon regeneration.Prong Retin Eye Res,2000,19(2):171-204.
5 Dedkov EI,Kostrominova TY,Borisov AB,et al.Survival of Schwann cells in chronically denervated skeletal muscles.Acta Neuropathol(Berl),2002,103(6):565-574.
6 朱益华，朱捷，唐宝丰，等.视神经再生模型超微结构观察.福建医科大学学报，2003，37(1)：35-37.
基金项目：福建省科技厅重大科研项目(编号：2000F005)
作者单位：1 350005 福建福州，福建医科大学附属第一医院眼科
2 353000 福建南平，福建省南平市第一医院眼科
3 350004 福建福州，福建医科大学病理系
(编辑：明 石)