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【摘要】 目的 将荧光金（flurogold,FG）注射于SD大鼠上丘，观察到被FG逆行标记的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)，以及SD大鼠RGC的数目及分布。方法 用3%FG双上丘注射，逆行标记RGC。5天后做视网膜定向铺片，在荧光显微镜下距离视乳头中心上下左右各2mm拍摄照片。利用计算机图像分析系统做RGC计数。结果 右眼RGC单位面积数量472.9±54.13，左眼RGC单位面积数量471.5±52.54。双眼RGC单位面积数量相比差异无显著性（P>0.05）。视网膜血管自视盘发出呈放射状，血管走行区无标记细胞。距视盘2mm始RGC分布较致密，视网膜周边部细胞分布较为稀疏。结论 用荧光金逆行标记上丘方法来标记RGC，是实验条件下研究RGC数量动态变化的可靠、有效方法。
【关键词】 视网膜神经节细胞;荧光金
Retinal ganglion cells retrograde labelled by injection of fluorogold
LI Yue-hua，MA Ke，Xu Liang.
Department of Ophthalmology,Beijing Chaoyang Hospital,Beijing 100020，China
【Abstract】 Objective Retinal ganglion cells (RGC) were retrograde labeled by injection of 3% fluorogold into both side of superior colliculus to observe the numbers and distribution of RGC .Four photographs were taken from every quadrant of the retina 2mm from the center of optic disc. Retinal ganglion cells were quantitatively analyzed by computer.Methods To identify RGC,we applied the 3%fluorogold to the superior colliculi.The retinal were examined through a fluorescence microscope after 5 days,four photographs were taken from every quadrant of the retina 2mm from the center of optic disc. Retinal ganglion cells were quantitatively analyzed by computer.Results The numbers of RGC were not significantly different between two groups. The numbers of right eye was 472.9±54.13.The numbers of left eye was 471.5±52.54.Conclusion The method that retinal ganglion cells (RGC) retrograde labeled by injection of fluorogold is reliable and effective.
【Key words】 retinal ganglion cells;fluorogold
视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGC）的慢性进行性丢失是青光眼最主要的病理生理学特征。高眼压、缺血等原发性损伤首先引起一部分RGC的丢失，丢失的节细胞产生出许多毒性物质，使其周围RGC的生存环境恶化，细胞膜离子通透性增加，线粒体膜遭受损害，致使细胞进入凋亡程序，导致细胞丢失［1］。因此准确的RGC计数是研究青光眼发病机制及视神经保护治疗的关键指标。该实验将荧光金（flurogold,FG）注射于SD大鼠上丘，观察到被FG逆行标记的RGC，以及SD大鼠RGC的数目及分布。
1 材料与方法
1.1 试剂与器械 荧光金（荧光金公司，美国），脑立体定位仪900型（David Kopf仪器公司，美国），荧光显微镜（AH-2，奥林巴斯公司，日本），联想Mustek扫描仪。
1.2 实验动物 Sprague-Dawley大鼠10只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。雄性，重量200～240g,裂隙灯检查大鼠前节，包括角膜、前房、虹膜和晶状体无异常改变。Mydrine散瞳，检眼镜观察眼底，包括视盘、眼底血管及部分视网膜无异常改变者。实验动物在12h光照/12h黑暗的条件下饲养。
1.3 逆行标记 采用双上丘注射法逆行标记RGC。大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮与地西泮注射液的等量混合液3ml/kg进行麻醉，将其固定在脑立体定位仪上，0.5%碘伏消毒皮肤，于正中切开皮肤向下分离达颅骨。牙科钻钻开颅骨相应部位，用微量注射器吸取3%FG（溶于0.9%生理盐水中），每侧上丘注射两点（前囟后5.9 和 6.4mm，旁开1.4mm，深4.0mm），每点注射1.5μl，留针5min。
1.4 视网膜定向铺片 实验第5天，实验动物在深麻醉下，于上方12点处做球结膜缝线标记，立即取出眼球固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中2h。沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，去除角膜和晶状体，分离视网膜并将其定向平铺，空气中自然干燥，市售无色指甲油封片。
1.5 荧光照片RGC计数 在荧光显微镜下使用V波段荧光激发，距视盘中心2mm上下左右各拍摄照片1张，照片放大倍数125×，分别代表上、下、左、右四个象限的RGC数量。
1.6 图像分析 使用联想Mustek扫描仪将照片以100dpi扫入计算机，使用彩色颗粒分析软件（CPAS）进行节细胞计数，将上、下、左、右4张照片节细胞数量累加，代表该眼节细胞单位面积数量。
1.7 统计学方法 使用SPSS for Windows 10.0统计软件包，采用配对t检验，P<0.05差异具有显著性，P<0.01差异具有非常显著性。
2 结果
2.1 FG标记的RGC的形态 在FG标记后5天，大鼠视网膜铺片观察到标记的RGC细胞质中荧光均匀，边界清晰，有些细胞可见有荧光充盈的细胞突起，细胞外无荧光染料渗漏（见图1）。
2.2 RGC计数及分布双眼RGC单位面积数量 见表1。两眼相比较差异无显著性（P>0.05）。视网膜血管自视盘发出呈放射状，血管走行区无标记细胞。距视盘2mm始RGC分布较致密，视网膜周边部细胞分布较为稀疏（见图2）。但细胞内荧光仍较明显。
表1 双眼RGC单位面积数量 略
3 讨论
利用轴浆流逆向输送的特点，在颅内RGC投射的核团上丘、外侧膝状体［2］、视神经断端近眼球一侧放置辣根过氧化物酶或Diamidido Yellow，FG(Fluorogold),Evan Blue,Fluoro-Ruby(FR)［ 2～5］等各种荧光物质，通过逆向轴浆流将这些物质带到RGC胞体内，产生特定的染色效果，标记出RGC，而RGC层中的其他细胞则不能着色。而HRP参与细胞代谢，不能在细胞内长期存留。某些示踪剂如快蓝、核黄等，易于从标记细胞内扩散到周围组织，且照射时褪色较快，即使保存在低温、避光条件下，仍不能长期保存。另外应用传统的组织化学技术无法将RGC与视网膜内其他神经元严格区分，尤其是与移位的无长突细胞鉴别。利用轴浆流逆向输送的特点，目前多用荧光金逆行标记上丘方法来标记RGC，是实验条件下研究RGC数量动态变化的可靠、有效方法。
荧光金在紫外线照射下，其激发光波长323nm,发射光波长为408nm，标记的RGC呈金黄色强荧光，能标记细胞质，而细胞核不着色，能很好显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，不易扩散，与周围组织分界清晰，除RGC层外，其余各层中均无荧光标记的细胞。Selles-Navarro I［6］等研究发现应用荧光金行上丘逆行标记RGC后，细胞质内荧光金的存在不超过3周，标记后12天、14天、21天与标记后37天有明显差异。随时间进展荧光金可能丢失荧光或被代谢［7］。该实验于动物处死前5天行荧光金逆行标记上丘，标记的RGC呈金黄色强荧光，各象限均匀。通过逆行标记RGC可以记录它的累积丢失，比通过凋亡标记（如TUNEL染色）更好，通过凋亡标记在一定的时间只能看到少量细胞［8］。此标记方法广泛应用于RGC的发生和凋亡［9］、视网膜缺血［6］、视神经横断、视神经再生的研究。
该实验的标记方法为两点法双侧上丘注射，因为有95%以上的大鼠RGC投射到上丘［10］，10%左右的RGC的轴突投射到同侧外侧膝状体。因此，采用对侧上丘注射标记单眼RGC的方法并不可靠，至少有10%的RGC不被标记。上丘注射法还包括一点法［10］、三点法［11］。以往我们也采取过每侧上丘注射一点的标记方法，发现这种方法能够成功标记RGC的比率比较低，而且对注射精度要求高，注射点必须位于上丘中心（前囟后5.3mm中线外2mm,深4.5mm）。如果注射偏离上丘中心位置，将导致视网膜RGC标记的不均匀。改用双侧上丘两点注射法标记出的RGC分布均匀，对视网膜各象限RGC数的统计学检验差异无显著性。另外发现RGC数量从中心到视网膜周边并没有大幅度衰减。三点标记法耗时长、增加动物感染机会、损伤较两点法重。比较上丘一点注射法、两点注射法和多点注射法，认为两点注射法效率高，标记良好，有比较好的稳定性。
实验证明用荧光金逆行标记上丘方法来标记RGC，是实验条件下研究RGC数量动态变化的可靠、有效方法。
（本文图片略）
【参考文献】
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10 Levkovitch-Verbin H,Harris-Cerruti C,Groner Y,et al.RGC death in mice after optic nerve crush injury:oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000,41(13): 4169-4174.
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作者单位：1 100020 北京,首都医科大学附属北京朝阳医院眼科
2 100730 北京,首都医科大学附属北京同仁医院眼科研究
(编辑：刘 俊)