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【摘要】 目的 探讨内源性神经生长因子（nerve growth factor，NGF）在准分子激光原位角膜磨镶术（laser in situ keratomileusis，LASIK）后干眼中的作用机制。方法 LASIK术前及术后1天、2天、10天及30天在17例患者（34眼）下睑结膜囊内抽取泪液标本，采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法检测泪液中NGF含量，同时行泪膜稳定性的检查，并对两者行相关性分析。结果 NGF含量在术前平均值为（21.96±8.22）μg/ml，术后1天、2天、10天含量分别为(12.76±3.55)μg/ml、(11.01±4.66)μg/ml、(13.55±4.93)μg/ml，与术前比较差异有统计学意义（P<0.05）；术后30天含量(19.16±8.79)μg/ml，与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。术前泪膜破裂时间（breaking-up time，BUT）均值为(12.62±1.99)s，术后1天、2天、10天和30天分别为(4.68±1.77)s、(4.84±1.92)s、(7.36±1.53)s和(8.82±3.08)s，与术前比较差异有统计学意义(P<0.05)；术后1天与2天比较差异无统计学意义(P>0.05)，术后1天（2天）、10天、30天比较差异均有统计学意义(P<0.05）。泪液中NGF含量与泪膜稳定性具有正相关（r=0.484，P<0.01）。结论 LASIK术后泪液NGF的含量存在一个由降低到正常的动态变化过程，NGF含量变化是泪膜稳定性下降的相关因素之一。
【关键词】 准分子激光角膜切削术；神经生长因子；泪膜稳定性；干眼
Relationship between the levels of nerve growth factor in tears and tear film stability after LASIK
CAO Yu-jin，TANG Ren-hong.Department of Ophthalmology，The Third Hospital of Xiangya of Center South University，Changsha 410013，China
［Abstract］ Objective To study the mechanism of endogenous nerve growth factor(NGF) in the dry eye after LASIK.Methods Nerve growth factor levels in the tears of 34 eyes before and after LASIK were studied with a monoclonal antibody based ELISA before LASIK and 1 day，2 days，10 days，and 30 days after LASIK.Tear film stability was examined during the same visits.And then the relationship between the levels of NGF in tears and tear film stability in the eyes of pre and postoperative LASIK patients was studied.Results Mean value of NGF before LASIK was (21.96±8.22)μg/ml and mean values at 1 day，2 days，10 days and 30 days after LASIK were(12.76±3.55)μg/ml，(11.01±4.66)μg/ml，(13.55±4.93)μg/ml，(19.16±8.79)μg/ml，respectively.The NGF levels in tears at the first three visits post-operation were significantly different from levels in the pre-operative group.(P<0.05).However，There was no significant difference between the pre-surgical level and the level at the 30 days visit post-operation(P>0.05).Tear film stability before LASIK was(12.62±1.99)seconds，and at 1 day，2 days，10 days and 30days after LASIK，it was(4.68±1.77) seconds，(4.84±1.92) seconds，(7.36±1.53)seconds，and (8.82±3.08)seconds，respectively.Tear film stability at the time of the four visits after surgery was significantly different from the preoperative level (P<0.05).There was a positive correlation between tear film content and changes in tear film stability after LASIK(r=0.484，P<0.01).Conclusion The decrease of BUT is the cause of dry eye and the changes in tear film stability and the onset of dry eye after LASIK are related to the level of NGF.
［Key words］ LASIK;nerve growth factor;tear film stability;dry eye
近年来，准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis，LASIK)成为屈光手术的主流手术。除了视力的上升，视觉质量以及舒适度也成为患者追求的目标。然而术后患者常常出现眼干涩、异物感、易疲劳等干眼症状，在一定程度上影响了视觉质量。有研究表明局部应用含神经生长因子（nerve growth factor，NGF）滴眼液可以改善LASIK术后患者的干眼症状。神经生长因子存在于角膜组织［1，2］，其含量的稳定性是维持正常角膜上皮完整和角膜感觉的重要因素。LASIK术后角膜NGF含量变化国内外文献鲜有报道。本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（avidin-biotin peroxidase complex enzyme-liked immunosorbent assay，ABC ELISA ）测定LASIK手术前后泪液中NGF水平的变化，结合泪膜稳定性检测，对NGF与干眼关系进行探讨。
1 对象与方法
1.1 对象选择 选取2006年9～11月在我院行LASIK手术患者17例（34眼），性别不限，年龄为18～32岁，平均（22.19±4.58）岁。术前等效球镜度数为（-3.65±1.90）DS。病例选取标准：（1）无角膜接触镜配戴史；（2）屈光度稳定2年以上；（3）没用过影响泪液分泌及泪膜稳定性的药物(抗青光眼药物、皮质类固醇药物等)；（4）术前经过裂隙灯及眼底检查，排除眼科其他疾病，如干眼（参照刘祖国干眼诊断标准［3］）、圆锥角膜、慢性泪囊炎、病毒性角膜炎活动期、青光眼、视网膜病变及视神经病变；（5）排除全身结缔组织疾病及自身免疫性疾病，如系统性类风湿关节炎、多发性硬化、严重的糖尿病及妊娠等；（6）近视度数不超过-10.00 D；（7）患者中央角膜厚度不低于500 μm。
1.2 检查项目 常规检查裸眼视力、矫正视力、裂隙灯眼前节检查、角膜地形图、超声角膜测厚、眼压测量、散瞳查眼底、主客观验光等。
1.3 泪膜稳定性测定（BUT） 荧光素钠滴入患者结膜囊后，在裂隙灯下用钴蓝滤光片观察一次瞬目到泪膜出现干斑所需要的时间。双眼分别测量3次取平均值。
1.4 手术方法 手术采用120刀头行角膜瓣切削，角膜瓣蒂位于上方，切削厚度均为160 μm。
1.5 术后用药 按常规术后用药。
1.6 泪液标本收集 分别于术前和术后1天、2天、10天、30天收集泪液。表麻下将厚度为0.5 mm、直径3 mm圆形滤纸片（吸附体积约为6.5 μl）放入患者眼下穹隆部中外1/3结膜囊内，嘱其轻闭双眼。待滤纸片湿透达到充分饱和后取出，并立即放入EP试管内于-60 ℃冰箱内保存待检。全部病例均在相同条件下采集泪液作为样本。
1.7 NGF水平的测定 采用ABC ELISA法。NGF检测盒(购自武汉博士德公司)，96孔聚苯乙烯酶标板(美国Nunc公司生产)，Thermolab systems multiskan MK3型酶联免疫检测仪。
1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示；组间差异采用单因素方差分析；多个样本均数间的两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
LASIK手术前后泪液的NGF平均含量和BUT均值结果，见表1。LASIK术后1天、2天、10天泪液NGF平均含量较术前减少，差异有统计学意义（P<0.05）；术后30天NGF含量与术前比较差异无统计学意义（P>0.05）。LASIK术后各时间点BUT与术前比较差异均有统计学意义(P<0.05)；术后1天与术后2天比较差异无统计学意义(P>0.05)；术后1天（2天）、10天、30天比较差异均有显著性(P<0.05)。表1 LASIK手术前后NGF平均含量和 BUT均值 注：与术前平均含量比较，*P<0.05
LASIK手术前后泪液NGF含量与相应的BUT值进行Pearson直线相关性分析显示，两者呈正相关(r=0.484，P<0.01)。
3 讨论
神经生长因子是一种小分子多肽类神经营养因子。除角膜神经外，角膜上皮细胞、内皮细胞及基质细胞也能合成释放NGF并存在其受体TrkA［4，5］。Lambiase等［6］运用自制NGF滴眼液治疗12例患有神经营养性角膜溃疡的患者，2个月内所有病例全部愈合。由此可以推断，NGF是营养角膜组织，促进受损神经再生和维持健康角膜感觉的重要因子。LASIK手术不可避免的损伤角膜组织及角膜神经，术后患者常出现角膜知觉减退、眼干涩、异物感等眼表不适症状。为此笔者研究泪液中NGF含量变化规律，以便更好地改善术后患者的视觉质量。
当任何原因引起泪液质和量或动力学异常导致泪膜不稳定，并伴有眼部不适症状时，称之为干眼［3］。唯一直接测定泪膜稳定性的方法是泪膜破裂时间。LASIK术后以荧光素染色法测定LASIK术前、术后的BUT结果显示：术前平均BUT：（12.62±1.99）s，术后1天：（4.68±1.77）s，术后2天：（4.84±1.92）s，术后10天：（7.36±1.53）s，术后30天：（8.82±3.08）s。术后各时间点泪膜破裂时间与术前比较均缩短，差异有统计学意义（P<0.05），且以术后1天和2天缩短最为明显。与王礴等［7］研究结果相似，LASLK术后出现眼干症状的原因主要与泪膜稳定性下降有关，术后BUT较术前有下降，但处于一个逐渐恢复的过程。
本研究结果发现，LASIK术前泪液中NGF均值（21.96±8.22）μg/ml，术后1天、2天、10天分别为（12.76±3.55）μg/ml、（11.01±4.66）μg/ml和（13.55±4.93）μg/ml，与术前比较差异有统计学意义（P<0.05）；术后30天为（19.16±8.79）μg/ml，与术前比较差异无统计学意义（P>0.05）。提示LASIK术后早期角膜NGF含量降低，后随时间逐渐恢复，于术后30天左右恢复至正常水平。我国吴莹等［8］通过免疫印迹法检测LASIK术后兔角膜NGF蛋白表达发现，术后1天、3天，角膜NGF蛋白表达较正常对照少，差异有统计学意义（t=-12.52，-9.95;P=0.001）；术后7天、1个月，角膜NGF蛋白表达与正常对照接近（P>0.05）。与笔者的研究相似，术后NGF含量也存在一个降低到正常的动态变化过程。但其NGF蛋白表达恢复正常的时间较本实验短，可能因为实验对象，实验方法以及对角膜切削深度不同所致。
LASIK术后早期NGF含量较术前明显降低，可能是手术中角膜神经大范围受损，术后角膜知觉严重下降，导致NGF分泌减少。角膜神经纤维在角膜中央区为3～9点水平走向，LASIK术中角膜瓣蒂的位置直接影响受损角膜神经数量。由于本试验LASIK手术采用的是上方角膜瓣，术中角膜大部分神经被切断，术后角膜感觉丢失较多。同时，角膜上皮、基质受损也影响了术后早期NGF的分泌。由于角膜创伤修复过程的发生，角膜内细胞因子相互作用，角膜上皮、角膜基质等相继修复，角膜NGF分泌开始增加，术后30天内NGF含量又恢复到术前水平。中央角膜知觉也在1个月内恢复［9］。而Lee等［10］研究发现上皮下神经丛术后1年未完全恢复。则可能因为神经损伤过多，分泌功能相对有限，内源性NGF含量的恢复远不能达到神经修复所需水平，因此在相当长的时期内，患者术后存在角膜内神经纤维丧失。
同时研究表明，术后NGF的含量变化与相应时间点BUT值成正相关(r=0.484，P<0.01)，提示NGF分泌减少是泪膜稳定性下降的相关因素之一。LASIK术后干眼可能与神经生长因子在神经受损后释放减少，影响了角膜上皮的营养和代谢活动有关。
综上所述，LASIK术后泪液NGF的含量存在一个由降低到正常的动态变化过程，NGF含量变化是泪膜稳定性下降的相关因素之一。LASIK术后局部补充NGF可以加快角膜组织修复及知觉恢复，促进角膜神经再生，有助于缓解干眼症状。
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7 王礴，刘汉强，李敏，等.准分子激光角膜原位磨镶术后泪膜变化及与角膜知觉关系的研究.中国实用眼科杂志，2003，21(7)：506-510.
8 吴莹，褚仁远，周行涛，等.LASIK与epi-LASIK术后角膜中神经生长因子变化实验研究.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，2006(6)：570.
9 许琛琛.准分子激光屈光性手术对泪膜稳定性的影响.眼视光学杂志，1999，1(4)：219-221.
10 Lee BH，McLaren JW，Erie JC，et al.Reinnervation in the cornea after LASIK.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43：3660-3664.
作者单位：410013 湖南长沙，中南大学湘雅附三医院眼科（△通讯作者）