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【摘要】 目的 探讨翼状胬肉组织中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16的表达，了解其在翼状胬肉发病机制中的作用。方法 手术切除的翼状胬肉及正常结膜组织标本，采用免疫组化方法进行细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16蛋白检测。结果 翼状胬肉中P16表达为（7.25±0.12）％，而正常结膜组织中P16表达为（88.47±0.73）％，两组差异有极显著统计学意义（P＜0.01）；细胞增殖性核抗原（PCNA）在正常结膜组织及翼状胬肉中表达分别为（4.98±0.28）％和（24.59±0.64）％（P＜0.01）。结论 翼状胬肉中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16的低表达可能导致翼状胬肉细胞周期紊乱，其增殖失去控制。
【关键词】 翼状胬肉；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；增殖性细胞核抗原
Study on expression of cyclin kinase inhibitor P16 in pterygium
ZHANG Ming-chang，WANG Yong.Department of Ophthalmology,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China
［Abstract］ Objective To observe the expression of cyclin kinase inhibitor P16 in pterygium and to investigate its effects on the pathogenesis of pterygium.Methods The normal conjunctiva tissues and pterygium were detected for cell circle related kinase inhibitor P16 with immunohistochemistry.Results The expression rates of P16 in conjunctiva and pterygium were（88.47±0.73）％and（7.25±0.12）％,there was significant difference between them（P＜0.01）.The expressions of PCNA in conjunctiva and pterygium were （4.98±0.28）％ and （24.59±0.64）％（P＜0.01）.Conclusion The lower expression of cell circle related kinase inhibitor in pterygium may play an important role on proliferation and pathogenesis of pterygium.
［Key words］ pterygium；cyclin-dependent kinase inhibitor； PCNA
翼状胬肉是眼科常见疾病，其发病机制至今尚不清楚，尤其是翼状胬肉中细胞增殖失控是否与细胞周期紊乱有关，目前已有研究［1］表明，这种紊乱是否与其依赖性激酶及正调控亚基（cyclin）、负调控亚基（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）成员的表达失衡有关。本研究通过对翼状胬肉中细胞周期依赖性激酶抑制剂P16蛋白的检测，探讨翼状胬肉的发生及发展与细胞周期依赖性激酶抑制剂的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2005年4月~2006年4月取协和医院手术室行翼状胬肉切除的成人患者11例及外伤行眼球摘除患者的正常结膜标本3例。
1.2 方法 翼状胬肉头部立即用10％甲醛固定，常规逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡后包埋，5 μm连续切片。免疫组化染色：鼠抗人P16蛋白单克隆抗体来自北京中山生物技术公司。石蜡切片常规脱蜡复水，0.3％过氧化氢室温孵育，抗原修复，正常山羊血清封闭，滴加适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜，滴加生物素标记的二抗工作液，滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，DAB显色。每批染色均设有阳性对照和阴性对照，其中阳性对照用已知阳性表达的乳腺癌标本，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。
1.3 P16表达检测 在光镜下观察免疫组化染色切片，P16抗体染色阳性的细胞胞核呈棕黄色粗大颗粒反应，染色阴性细胞胞核则无棕黄色染色。
1.4 结果判定 在400倍光镜下，每张切片随机计数500个细胞， 计算其阳性率，阳性率＝（所计数的500个细胞中阳性细胞数/500）×100％。
1.5 统计学方法 结果采用t检验进行统计学分析。
2 结果
P16正常结膜组在上皮细胞全层均有表达，见图1，而翼状胬肉组P16仅在上皮层见极少数细胞微弱表达；翼状胬肉中P16表达率为（7.25±0.12）％，而正常结膜组织中P16表达率则为（88.47±0.73）％，两组经统计学分析，差异有显著统计学意义（t检验，P＜0.01）。PCNA在正常结膜组织及翼状胬肉中表达分别为（4.98±0.28）％和（24.59±0.64）％，P＜0.01。
图1 P16在正常结膜上皮表达
3 讨论
虽然对翼状胬肉病因及发病机制进行了大量研究，但到目前为止，仍不十分清楚。有研究表明PCNA在翼状胬肉内呈现高表达，说明在翼状胬肉中存在明显活跃的细胞增殖［2］，而这种异常的细胞增殖源于细胞周期活动的紊乱。王勇等［1］ 研究显示细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P27在翼状胬肉中低表达，本研究发现在细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中另一成员P16也在翼状胬肉中的表达显著降低。
细胞周期中存在一些的控制，细胞周期的进展速度控制是由内特异性细胞周期依赖性激酶（cyclindependent kinase， CDK）、细胞周期依赖性激酶细胞正调控亚基及其负调节亚基 CDK抑制蛋白（CKI）共同完成的。已有较多的研究涉及肿瘤及增殖性疾病与细胞周期调控的关系［3］。宁宏等［4］通过检测家兔晶状体皮质吸除术后不同时间晶状体上皮细胞中的P27蛋白进行检测，发现随着术后时间的延长，P27阳性细胞数量显著增多。吴明星等［5］ 研究人类晶状体上皮细胞中CDK－E、CDK2、P21的表达，结果示在蛋白水平和转录水平都存在CDK－E、CDK2、P21的表达不平衡，从而推测术后晶状体后囊混浊（PCO）的发生可能是白内障术后特定的时限内存在CDK和CKI表达的失衡，而启动细胞增殖的过程，引起后囊膜表面的细胞增殖移行并导致其混浊。由此可见，CKI与白内障的发生有着密切关系。
本研究进一步表明CKI相关基因在翼状胬肉细胞中的失活，细胞周期紊乱，可能诱导其增殖失控，因此CKI相关基因在翼状胬肉细胞中的低表达及失活可能是翼状胬肉发生发展的重要原因。
【参考文献】
1 王勇，张明昌.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂在翼状胬肉的表达研究.眼科新进展，2005，25（1）：52.
2 龙心光，王映芬，黄应桂,等.翼状胬肉中增殖细胞核抗原的免疫组化研究.中华眼科杂志，1999,35（5）:327.
3 Pestell RG,Albanese C,Reutens AT,et al.The cyclins and cyclin-Dependent kinase inhibitors in hormonal regulation of proliferation and differentiation.Endocr Rev,1999,20（4）:501-534.
4 宁宏，赵平，张劲松,等.细胞周期素依赖激酶抑制剂P27Kip1在兔晶状体上皮细胞增殖过程中的作用.中华眼科杂志,2002,38 （6）:378-379.
5 吴明星，李绍珍，曾骏文,等.永生化人晶状体上皮细胞细胞周期调控相关基因表达的检测.中华眼科杂志，2002,38（6）:367-371.
作者单位：430022 湖北武汉， 华中科技大学同济医学院协和医院眼科