膜酶免疫分析法快速检测呼吸道标本中的流感病毒

　　流感病毒是重要的呼吸道感染病原体，可引起人类发生从感冒、咽喉炎、主支气管炎、支气管炎到肺炎的全气道感染，也是成人慢性气流限制性疾病急性加重的重要感染性因素。流感病毒可分为A、B、C 3型，其中以H3N2为代表的流感病毒A是目前致流行性感冒广泛爆发的主要病原体，带来社会和经济上的问题。流感病毒感染可能在老年人、儿童、孕妇和伴发呼吸道疾病的人群中造成严重的并发症，鉴于患者的病情可能急剧恶化，快速诊断和治疗非常必要。病毒分离曾被用作流感病毒检测传统的金标准，但需要复杂的无菌步骤且耗时较长，不利于感染的早期诊断。

　　本文的目的是介绍膜酶免疫分析法快速检测呼吸道标本中的流感病毒A型和B型抗原。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象  2004年3月初发热门诊就诊的61例呼吸道感染患者和28例健康入托幼儿。

　　1.2  材料  基于膜酶联免疫分析法的流感病毒A型和B型检测试剂盒INFLU A.B-QUICK“SEIKEN”为日本生研株式会社产品，制造番号333031。试剂盒的主要成分有：抗体包被板条，每份的A、B孔内分别包裹抗流感病毒A型单克隆抗体10μg和抗流感病毒B型单克隆抗体5μg；标本缓冲液，为PBS溶液，含牛血清白蛋白（0.5%w/v）和叠氮化钠（0.08%w/v）；阴性对照为牛血清白蛋白溶液（1%w/v），含叠氮化钠（0.08%w/v）；阳性对照为灭活的流感病毒A型和B型溶液，叠氮化钠（0.08%w/v）；碱性磷酸酶标记的抗流感病毒A型和B型单克隆抗体溶液各1份，浓度均为8μg/ml；底物为含5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（150μg/ml）和消基四唑蓝（300μg/ml）的溶液；冲洗液：氨基丁三醇缓冲液，含叠氮化钠（0.08%w/v）；终止试剂的主要成分为柠檬酸（21mg/ml）。其他材料有过滤器，专用无菌拭子等。

　　1.3  标本的采集和制备  将无菌拭子经口腔缓慢地插入咽部，对咽后壁和扁桃体充分地拭抹数次以获得标本。标本采集后，立即将咽拭子浸入装有1ml标本缓冲液的小瓶中，并按压拭子于小瓶内壁数十次使彻底混匀，充分挤出拭子顶端的液体，弃去棉签，接上滤帽。

　　1.4  测试步骤  操作在15℃～25℃的环境进行。步骤：（1）取出抗体包被条，确认板条的适配器正确接上后，在A孔和B孔中小心加入200μl标本，直到溶液通过膜被完全吸收；（2）将碱性磷酸酶标记的A型和B型单克隆抗体各200μl分别加入A孔和B孔，大约3min后溶液通过膜被完全吸收；（3）小心移去适配器，在两孔内各加入200μl冲洗液；（4）冲洗液通过膜被吸收后，分别加入250μl底物溶液，反应持续(10±0.5)min；（5）各加5滴终止试剂停止反应，4h内观察结果。

　　1.5  结果的判读  严格按照产品的说明进行，若在A孔内观察到紫红色菱形，且A孔和B孔内都可看到质控斑，该结果判读为流感病毒A型阳性且B型阴性；若在B孔内观察到紫红色菱形，且A孔和B孔内都可看到质控斑，该结果判读为流感病毒B型阳性且A型阴性；若在A、B孔内观察到紫红色菱形，且A孔和B孔内都可看到质控斑，该结果判读为流感病毒A型和B型均阳性；若在A、B孔内都没有紫红色菱形，且A孔和B孔内都可看到质控斑，该结果判读为流感病毒A型和B型均阴性，且A孔和（或）B孔内都未看到质控斑，则为无效结果（附图1～5）。最后测试结果与临床实验室用酶联免疫吸附试验（液相）检测流感病毒总抗体的结果比较。

　　图1  流感病毒A型抗原阳性   略

　　图2  流感病毒B型抗原阳性　略

　　图3  流感病毒A型和B型抗原均阳性   略

　　图4  流感病毒A型和B型抗原均阴性　略

　　图5  无效结果(略)

　　2  结果

　　本组61例发热患者中，男36例，女25例，年龄范围为10个月～13岁，平均年龄5.5岁。所有的患者都有不同程度的发热,体温范围为38℃～40.7℃，其中38℃～38.9℃ 13例，39℃～40℃ 43例，>40℃5例。经膜酶联免疫分析法测试结果显示，所有患者B型流感病毒抗原阴性；6例患者A型流感病毒抗原阳性，阳性率达9.8%，其中男3例（分别为2岁、3.5岁和8岁），女3例(分别为9个月、6岁和7.5岁)，就诊时体温均>39℃(39℃～40.5℃)，6例患者均未接种过流感病毒疫苗。所有健康儿童A型和B型流感病毒抗原均阴性。研究结果与临床实验室酶联免疫吸附试验检测A和B型流感病毒总抗体的结果完全一致。

　　3  讨论

　　流感病毒膜酶免疫分析法的原理是标本中的流感病毒A型和（或）B抗原同包被于硝化纤维膜上的抗流感病毒A或B型单克隆抗体发生反应并形成各自的复合物，该复合物再分别同碱性磷酸酶标记的抗流感病毒A或B型单克隆抗体发生第2次反应，结果形成了抗流感病毒A或B型单克隆抗体-流感病毒A或B型抗原-碱性磷酸酶标记的抗流感病毒A或B型单克隆抗体三联复合物，当底物被加入，由于附着于硝化纤维膜上的碱性磷酸酶的存在，会发生着色反应，特异性的抗原抗体反应就产生了结果。

　　用膜酶免疫分析法特异性地检测和鉴定标本中的流感病毒A型和B型抗原，分别使用了针对流感病毒A型和B型各亚型共同的核蛋白体的特异性单克隆抗体，步骤简便，15min内出结果；设计有质控斑可保证测试结果的可靠性，经本试验也证实结果可信，适用于小批量样本，对从喉和鼻咽拭子及鼻吸出物中快速鉴定流感病毒A或B型可提供支持性的检测结果。

　　(致谢：浙江大学医学院附属儿童医院李建平老师和浙江大学幼儿园汤雪琴老师曾为该试验提供帮助，在此深表感谢。)

　　作者单位： 310012 浙江杭州，杭州师范学院医学院

　　(编辑：含  秋)