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人类基因组计划的完成，标志着后基因组时代即功能基因组时代的到来。基因仅是遗传信息的携带者，而生命活动的本质却是不同功能蛋白质在时间和空间上有序和协同作用的结果。仅从mRNA表达水平并不能预测蛋白的表达，同时蛋白质的翻译后修饰（如糖基化、磷酸化、乙酰化）、剪切加工（如酶原降解、结构域拼接）、转运定位、结构变化、蛋白与蛋白分子及其它分子的相互作用等均无法在基因水平上获知。基因组计划的实现并不能提供认识各种生命活动直接的分子基础，还有待于在蛋白质层面予以揭示和阐述。随着人类蛋白质组计划的实施，蛋白质组研究已成为21世纪生命科学的焦点之一。
肝肿瘤是一种多基因参与的复杂疾病，应用蛋白质组学技术能够动态、整体、定量地观察肝肿瘤发生、发展过程中蛋白质种类和数量的变化，可确定全部蛋白质表达谱，有助于进一步阐明肝肿瘤的发生、发展机制，发现新的预警分子、诊断标志、药物靶标和创新药物。
1 蛋白质组学及其在医学研究中的意义
1994年Wilkins和Wiliams首先提出了蛋白质组的概念 ［1］ ，其定义是某一种细胞、组织或生物体的基因组在特定的时间和空间上所表达的全部蛋白质及其存在方式。以蛋白质组为研究对象，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控活动规律的学科称为蛋白质组学。蛋白质组学的研究范畴包括对所有蛋白质和蛋白质间以及蛋白质与核酸间相互作用的研究，蛋白质组及其组成质点的分离、分析与鉴定，蛋白质结构分析，生理与病理状态或不同发育阶段的蛋白质组表达差异的研究以及丰富与完善蛋白质信息库等。研究表明，大约仅有2%的疾病与基因序列有关，约98%的疾病与蛋白质的表达有关 ［2］ 。应用高通量的蛋白质组技术可以整体研究某种疾病引起的蛋白表达或修饰的变化，揭示在病理状况下异常表达的蛋白质以及疾病不同时期的蛋白标志物，为了解疾病的发病机制，进行早期诊断、针对性治疗和预后判断提供依据。
此外，蛋白质组学在药学研究中也具有重要意义。通过比较药用活性化合物处理（治疗）前后，模型细胞或组织的蛋白质组的表达差异并鉴定发生了相应变化的蛋白质，可揭示药物的作用机理并进行新药筛选;通过对耐药和对药物敏感的致病菌蛋白质组的比较分析，可揭示致病菌耐药机制以及设计新的治疗药物。蛋白质组学也可用于发现新的药靶蛋白及进行药物的毒理学研究等。
近年来，蛋白质组技术也渐渐被引入到细胞凋亡、生殖医学和胚胎干细胞等研究领域，用于筛选与凋亡有关的蛋白，了解生殖以及胚胎早期发生与分化的分子机制。
2 蛋白质组学研究的相关技术
蛋白质组学研究主要依赖三大技术:蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术和生物信息学。
2.1 蛋白质分离技术 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 ［3］ （two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE）是使用最广泛的蛋白质分离技术，其原理是根据蛋白质的等电点和分子量的差异使之在二维平面上分开。目前，最多可分离到11000个左右蛋白样点 ［4］ 。另一种蛋白质分离技术是毛细管电泳（CE），其中应用较为广泛的是毛细管区带电泳（依据不同蛋白质的电荷质量比的差异实现分离）、毛细管等电聚焦（依据蛋白质等电点不同在毛细管内形成pH梯度而实现分离）和毛细管电色谱（毛细管电泳和液相色谱的融合技术）。CE具有灵敏度高、稳定性好、分离自动化和成本消耗少等优点。用于蛋白质组分离的技术还有二维层析、荧光差异显示双向电泳、二维液相分离和同位素亲和标签等。
2.2 蛋白质鉴定技术 分离后的蛋白质必须进行鉴定，蛋白质鉴定技术主要有质谱分析、Edman法、C-或N-末端氨基酸序列分析及氨基酸组成分析等。以质谱为基础的蛋白质鉴定技术，由于其灵敏度高（可达皮摩尔或飞摩尔），快速准确，易实现自动化，已成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。质谱技术 ［5］ （Mass spectrometry，MS）的基本原理是:通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，根据不同离子间的质荷比（m/z）来分离并确定分子量。目前，应用最广泛的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾离子串联质谱（ESI-MS-MS）。前者可得到酶解肽段的分子量，获得蛋白质的肽质量指纹图谱;后者可进行肽的测序，得到肽段的氨基酸序列。然后进行数据库检索，实现蛋白质的鉴定。近年来各种新质谱技术不断涌现，如杂交质谱技术（QQ-TOF）、电喷雾-离子阱质谱（ESI-IT-MS）、电喷雾-傅里叶回旋共振质谱（ESI-FTICR-MS）和基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱（MALDI-Q-TOF-MS）。
2.3 生物信息学 在蛋白质组分析的各个水平都需要生物信息工具。现在已有众多的软件应用于2-DE进行图像的扫描、剪辑和对比，如ImageMaster TM 、Melanie3、PDQuest TM 2-DE Analysis Software等。常用的蛋白质鉴定软件有SEQUEST、AACompIdent、PepˉtideSearch、Mascot和MS-Fit等。目前，许多国家都建立了各具特色的蛋白数据库，其中瑞士的SWISS-PROT是使用最广泛的蛋白数据库，它提供了众多的蛋白质数据，如蛋白质的表达、功能、结构域、突变体、蛋白加工和转移后的修饰等信息，以及齐全的引文和与许多其它数据库的链接，其网址是http://www.exˉpasy.ch/sprot/sprot-top.html。
3 蛋白质组学在肝肿瘤研究中的应用
肝肿瘤是严重危害人类生命健康的一种难治性疾病，它的发病机制、早期诊断和治疗仍是肝肿瘤研究者和临床医师所面临的主要挑战。特别是肝细胞癌（hepatocellular carcinomas，HCC），它是最常见的原发性肝肿瘤，全世界每年新增病例约超过50万，HCC起病隐匿、恶性程度高、进展快且预后差，近年来其病死率已分别上升为我国城市和农村恶性肿瘤病死率的第二位和第一位，被称为“癌中之王”。肝肿瘤的发生、发展是多基因、多步骤和多阶段的，而蛋白质组研究具有观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化的独特优势，蛋白质组学技术在肝肿瘤研究中的应用有望为征服这一顽疾带来新的契机。目前，国际上对肝肿瘤蛋白质组的研究多数以HCC为研究对象。
3.1 探讨肝肿瘤发生与发展的机制 肝肿瘤的发生发展涉及多个抑癌基因失活、癌基因激活、凋亡抑制及细胞周期失调等多步骤过程。蛋白质组技术的应用，为从整体上探索肝肿瘤发生中信号传导网络内蛋白质相互作用的机制提供了有力的工具。 Chevalier等 ［6］ 运用蛋白质组学方法，比较了大鼠原代培养的肝细胞在过氧化物酶增殖因子萘酚平（peroxisome proliferator nafenopin）和表皮生长因子（epiˉdermal growth factor，EGF）作用下的蛋白表达，发现了32种由过氧化物酶增殖因子萘酚平诱导的蛋白，包括毒蕈碱类乙酰胆碱受体3、中间丝波形蛋白等，从蛋白质水平上阐明了过氧化物酶增殖因子的致癌机制。HBV和HCV慢性感染患者是HCC发病的高危人群。Kim等 ［7］ 用2-DE和MALDI-TOF-MS对21例HCC患者（7名抗-HBV阳性、7名抗-HCV阳性、7名抗-HBV和抗-HCV均为阴性）的肝癌组织及其癌旁正常肝组织进行了分析，发现有60种蛋白的表达水平发生显著变化，其中14种蛋白在3类HCC患者中都有相同的变化模式，但另46种蛋白显示出特定的病毒标记，提示HCC的发病机制可能因感染病毒类型的不同而变化。
3.2 肝肿瘤标志物的筛选和鉴定 肿瘤标志物是由恶性肿瘤产生的或由肿瘤刺激的宿主正常细胞产生的，能反映恶性肿瘤的发生、生长及其对抗肿瘤治疗反应的物质，目前已成为蛋白质组研究的重点和热点，人们已在血清、细胞和组织水平进行了这方面的研究。
3.2.1 血清水平 Kennedy等 ［8］ 对33例HCC患者、19例肝硬化患者和19名健康人的血清进行了蛋白质组分析，鉴定出10种HCC特异蛋白，包括4种补体因子、结合蛋白1和结合蛋白2。Poon等 ［9］ 也对比了这三类人群的血清蛋白表达图谱，发现HCC患者血清中AFP、补体因子4和铜蓝蛋白表达上调;又通过对比肿瘤切除前后血清蛋白表达图谱，发现HCC特异性蛋白AFP异构体在肿瘤切除后不表达。Poon等 ［10］ 用蛋白质组技术对20例AFP<500μg/L的慢性肝病患者和38例HCC患者的血清蛋白进行了分析，发现有250种血清蛋白在慢性肝病和肝癌患者中的表达有明显差异。Wang等 ［11］ 用双向电泳技术对10例HCC患者和3例正常人的血清样本进行对比分析，发现23个差异蛋白点。用MALDI-TOF-MS鉴定出15个蛋白点，其中淋巴组织样限制性膜蛋白在HCC患者血清中表达下调，而转化生长因子-βⅢ受体、尿激酶纤维蛋白酶原激活受体及转录起始因子4D等表达下调。以上研究都揭示血清蛋白的变化可用于HCC的检测。
Steel等 ［12］ 对HCC发生各个时期的血清多肽进行蛋白质组分析，认为某些血清多肽表达量或翻译后修饰的变化可用于HCC高危人群的筛查、早期诊断和病程研究。他们又 ［13］ 分析了健康人、HBV携带者、慢性活动性HBV患者和有慢性HBV感染史的HCC患者的血清多肽，发现HCC患者血清中补体C 3 的羧基片段和载脂蛋白A 1 异构体表达量显著下降，揭示蛋白质组学的方法可以提高用于早期诊断的肿瘤标志物的检出率。
3.2.2 细胞水平 Seow等 ［14］ 分析了人肝癌细胞株HCC-M的蛋白质表达图谱，并对408个点进行了质谱分析，除了一些看家蛋白外，还检测到了可能与癌变有关的蛋白，如14-3-3蛋白、膜联蛋白、抗增殖蛋白和硫氧还蛋白过氧化物酶。Ou等人 ［15］ 又对这408个点中未鉴定出的29个点进行进一步分析，发现一些肿瘤相关蛋白，磷酸酪氨酸磷酸酶激活因子（PTˉPA）、RNA结合蛋白调节亚单位、复制蛋白A32KD亚单位和N-乙酰神经氨酸磷酸合成酶。Liang等 ［16］ 建立了HCC-M的双向电泳数据库。
3.2.3 组织水平 Lim等 ［17］ 用2-DE对比了6例HCC患者的正常组织、肝硬化组织和肝癌组织的蛋白表达图谱，发现32个蛋白点的表达水平发生了变化，用MALDI-TOF-MS鉴定出21个蛋白点，其中肌氨酸脱氢酶、肝羧酸酯酶、肽酰-脯氨酸异构酶A和核纤素B1被认为是新的HCC候选标志物，核纤素B1也可能是肝硬化的标志物。Kim等 ［18］ 用蛋白质组技术对11例HCC患者进行了分析，发现与正常肝组织相比肝癌组织中有9个蛋白点表达上调，28蛋白点表达下调，并用质谱对这37个点进行了鉴定，认为这些变化的蛋白点可作为HCC早期诊断的标志物和药物治疗的靶标。
醛糖还原酶是醛酮还原酶超家族中的一个成员，它催化各种糖类还原为多元醇。Jungblet等 ［19］ 用蛋白质组技术在N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea）诱导的小鼠肝癌中，发现了一种肝癌诱导的醛糖还原酶相似蛋白质，该蛋白优先在肝癌和胎肝中表达。经免疫组化证实，肝癌诱导的醛糖还原酶相似蛋白在成人肝脏中不表达，在小鼠肝癌中可以重新表达。该蛋白在癌前病变及肝癌中表达明显，而在周围正常组织中不表达，表明该蛋白与HCC有着密切的关系。
Zeindl-Eberhart等 ［20］ 对基因毒性亚硝基化合物—N-甲基-N-亚硝基脲、二乙基亚硝胺（diethylniˉtrosamine）、N-nitrosomorpholine及非基因毒性萘酚平致大鼠肝肿瘤进行蛋白质组分析，发现肝特异性酶3α-羟基类固醇脱氢酶及δ-3-甾酮-5β还原酶在所有样本中表达都下调，与肿瘤相关的鼠醛糖还原酶相 似蛋白Ⅰ（rARLP-1）和rARLP-1的3种变异体在亚硝基化合物所致的肝肿瘤中可以检测到，而鼠醛酮还原酶C（Rak-c）仅在N-甲基-N-亚硝基脲所致肝肿瘤中检测到。Zeindl-Eberhart等认为肝肿瘤发生时，3α-羟基类固醇脱氢酶及δ-3-甾酮-5β还原酶被鼠醛糖还原酶相似蛋白或鼠醛酮还原酶C等常在胚胎期表达的蛋白所代替。在此基础上，他们 ［21］ 又利用蛋白质组技术对人肝肿瘤进行了分析，发现了几种与肿瘤相关的蛋白，它们均是醛酮还原酶超家族的成员，其中人醛糖还原酶相似蛋白Ⅰ是最重要的肿瘤特异蛋白，它有4种亚型，在所有HCC患者的肿瘤样本中至少能检测到一种醛酮还原酶类蛋白，揭示该类蛋白可作为HCC诊断的标志物。
3.3 肝肿瘤治疗方面的应用 运用蛋白质组学技术，可以寻找肝肿瘤治疗的靶标，探讨药物作用机理，促进药物的开发和利用。Page等 ［22］ 对比了用抗肝癌化合物OGT719和5-氟尿嘧啶（5-FU）处理过的肿瘤细胞株的蛋白质组表达图谱，发现两者的图谱出现类似的变化，并鉴定出一种发生显著变化的蛋白质为核糖体RNA结合蛋白，揭示OGT719与5-FU作用机制类似。
3.4 肝肿瘤转移复发方面的应用 肝肿瘤治疗失败的主要原因是其远处转移和术后复发率较高。已有学者在蛋白质水平对肿瘤的转移、复发进行了研究。为探讨HCC的转移机制及寻找预后标志物，Ding等 ［23］ 用蛋白质组技术对高、低转移的HCC细胞株MHCC97-H和MHCC97-L进行了分析，在56个差异点中鉴定出14个蛋白点，其中丙酮酸激酶M 2 、泛蛋白羧基末端水解酶L 1 、层粘连蛋白受体（67KD）、S 100 钙离子结合蛋白A 4 、硫氧还蛋白和细胞角蛋白19在MHCC97-H中表达上调，而锰过氧化物歧化酶、钙网蛋白前体、组织蛋白酶D、乳酸脱氢酶B、不转移细胞蛋白Ⅰ、cofilinⅠ和网腔钙结合蛋白前体在MNCC97-H中表达下调，这些蛋白表达水平的变化可能与HCC的转移有关。
3.5 肝肿瘤的筛检 肝肿瘤早期发现、早期诊断及早期治疗的关键在于筛检。肿瘤的筛检是指从大量外表健康、无症状人群中，通过适当的检查方法，找出高度可能患肿瘤的个体，或检出有易发生肿瘤或发生无症状肿瘤危险因素的个体（高危者）。龙云铸 ［24］ 等，对14例HBV相关性HCC癌组织、6例肝硬化组织、4例慢性肝炎组织和4例正常肝组织蛋白质表达谱进行分析，在癌组织蛋白表达谱中发现了具有鉴别癌组织和非癌组织的蛋白质组模式，再应用该模式对48例未知的癌组织和非癌组织2-DE图谱进行检测，其灵敏度和特异性均达100%。提示蛋白质组模式技术有望成为在高危人群和普通人群中对恶性肿瘤进行筛查的工具。
4 展望
蛋白质组学技术已得到迅速发展，但仍难以实现对细胞和组织中的每一个蛋白质进行鉴定，特别是对低丰度、极酸、极碱、高相对分子质量和难溶性蛋白的分离和鉴定，同时，该技术在重复性、高通量和自动化等方面也有待进一步改进和完善。近年来，不断涌现的一系列新技术，如表面等离子共振、蛋白芯片和LCM-抗体芯片等将有望解决这些问题。尽管已应用蛋白质组技术对肝肿瘤进行了一系列的研究，但人们对肝肿瘤发生、侵袭及转移的机理仍不十分清楚。随着蛋白质组学技术的不断发展以及对胎肝发育、肝组织再生等与肝肿瘤发生类似的生理过程的研究，结合基础肿瘤学、临床肿瘤学的发展，特别是我国科学家领导的“人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）”的顺利实施，将为我们全面认识肝肿瘤并探索新的预防、诊断和治疗方法提供理论依据和基础。
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作者单位:400016重庆医科大学遗传优生教研室
（收稿日期:2004-07-20）
（编辑夏 继）